99Tcm标记小干扰RNA探针的干扰活性及其在荷瘤鼠体内的生物分布

康 磊,王荣福,闫 平,张春丽,刘 萌,徐小洁

(1.北京大学第一医院 核医学科,北京 100034;2.军事医学科学院 生物工程研究所,北京 100850)

恶性肿瘤作为目前严重危害人类生命健康和生存质量的疾病,一直被科学家广泛关注。端粒酶是恶性肿瘤细胞区别于正常细胞的一种生物标记物,其核心成分端粒逆转录酶(Human Telomerase Reverse Trancriptase,hTERT)是端粒酶的限速亚单位,是细胞癌变的关键环节[1]。随着 RNA干扰技术的深入研究,针对hTERT基因的有效RNA干扰序列已被筛选出来,为构建h TERT靶向的RNA探针奠定了基础。已有研究[2]证实hTERT靶向的反义寡核苷酸探针具备端粒酶体内显像的功能。类似于反义显像技术,可将放射性核素标记的人工合成小干扰RNA(Small Interfevene RNA,siRNA)技术引入体内,siRNA的反义链与靶基因通过碱基互补配对原则相结合,使用体外显像设备对其体内的分布情况进行示踪。而且,利用放射性核素对siRNA进行标记,不仅可以起到对标记探针的示踪作用,还能够利用siRNA与基因的特异性靶向结合的特性对靶向基因进行显像研究。

本课题组之前使用NHS-MAG3这一双功能螯合剂对siRNA进行99Tcm标记,获得了较理想的标记结果和体外稳定性[3]。在此基础上,本研究拟选择h TERT这一肿瘤特征性基因作为靶点,制备99Tcm标记的siRNA探针,通过评价其对hTERT高表达的肿瘤细胞的体外干扰活性及体内生物分布,探讨siRNA标记探针在端粒酶内示踪的应用价值。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

电子天平(FA1104):上海精科天平公司产品;恒压恒流器、蛋白电泳仪、湿性电转移仪:北京六一仪器厂产品;AXIMA-CFRplus电离飞行质谱仪:英国Kratos Analytical公司产品;凝胶成像分析系统(AlphaImager-2200):美国Alpha Innotech公司产品;二氧化碳培养箱:美国Thermo Electron公司产品;暗盒:北京普利莱基因技术有限公司产品;液氮罐、CO2罐:东亚公司产品;超净台:美国 Bio-Rad公司产品。RM905放射性活度仪:中国计量科学研究院提供;FT-163放射免疫测量仪:国营262厂产品。

1.2 主要材料与试剂

实验组siRNA的靶点为h TERT mRNA的第 3 119～3 137位核苷酸(19 bp),即 5′-TTTCATCAGCAAGTTTGGA-3′[4]。 对 照 组siRNA以人类无关基因序列为靶点,即 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′:由上海吉玛公司化学合成,2′-OMe修饰,3′端连接 d(TT)基团,5′端连接6碳己基及伯胺结构。S-乙酰基-NHS-MAG3:纯度 ＞99.9%,Hnatowich教授(University of Massachusetts Medical School)惠赠。

兔抗人 TERT、β-tubulin多克隆抗体:Santa Cruz公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体:北京中杉金桥生物技术公司;细胞转染试剂 Lipofectamine 2000、胎牛血清、高糖DMEM:美国Invitrogen公司。新华一号试纸、常用分析纯化学试剂:北京化学试剂公司。99Mo-99Tcm发生器:原子高科股份有限公司产品。Sephadex G25:美国GE Amersham公司产品。Hep G2肝癌细胞:美国ATCC中心提供。

1.3 动物模型

50只雌性BALB/c nu/nu裸鼠,体重(20±4)g,4～6周龄,SPF级别饲养:北京大学医学部实验动物中心。将处于对数生长期的HepG2细胞接种于裸鼠右侧腋下,SPF条件下饲养20 d,肿瘤体积长至约1 cm3进行动物实验。

2 实验方法

2.1 标记探针的制备

将反义链RNA与NHS-MAG3(N-hydroxysuccinimidyl Derivative of S-Acetyl Mercaptoacetyltriglycine,NHS-MAG3)混合振荡1～2 h,与正义链按摩尔比1∶1退火杂交成MAG3耦联的siRNA双链。在此siRNA双链中加入新鲜的SnCl2·2H 2O及新鲜淋洗的99TcmO4-液进行标记。标记反应路线示于图1。采用Sephadex G25对产品进行纯化。纸层析法分析其标记率和放化纯度:新华一号试纸为固定相,丙酮和生理盐水分别为展开剂。采用质谱法鉴定MAG3-RNA的结构。

图1 99Tcm标记的siRNA反应路线

2.2 体外hTERT蛋白抑制实验

使用Lipofectamine 2000分别将染脂质体、未标记和99Tcm标记的 siRNA转染至 HepG2细胞,72 h后收集细胞。未转染肿瘤细胞作对照。常规蛋白印迹(Western Blotting,WB)法鉴定hTERT和β-tubulin的蛋白含量。将聚丙烯酰胺(SDS)加入收集细胞中煮沸15 min,离心后取上清液进行聚丙烯酰胺差示(SDS-PAGE)凝胶电泳。继而电转移至硝酸纤维素膜上,使用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜。此后用5%脱脂奶粉稀释的抗hTERT和β-tubulin抗体室温孵育1 h,洗膜3次,再孵育以体积比 1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶耦联的羊抗兔IgG,洗膜后用化学发光法显色5 min,压片显影。

2.3 荷瘤鼠体内的生物分布

50只荷HepG2瘤裸鼠随机均分为两组,每组分别注射99Tcm标记的实验组探针和对照组探针。每只裸鼠尾静脉注射 200μL(1.85 MBq)99Tcm-siRNA。分别于注射后0.5、1、2、4、6 h摘眼采血100μL。脱颈处死后,取心脏 、肝脏 、脾脏 、肺脏 、肾脏 、胃 、小肠 、膀胱 、骨骼肌、小腿长骨、肿瘤,称重并测定其放射性计数,计算各组织的百分注射剂量率(%ID/g)及肿瘤与非肿瘤放射性摄取比(T/NT)。

2.4 统计学分析

各变量均使用¯x±s表示。方差分析ANOVA法进行数据统计。P值小于0.05认为具有统计学差异。

3 结果与讨论

3.1 99Tcm-siRNA的制备

NHS-MAG3的耦联产物经质谱鉴定,鉴定结果示于图2。耦联前RNA的相对分子质量为7 061.4,耦联后MAG3-RNA的相对分子质量为7 307.1,螯合前后的相对分子质量之差与理论值相符,证实RNA分子与NHS-MAG3的耦联成功。

NHS-MAG3耦联的 siRNA双链与99Tcm在室温下反应1 h可得99Tcm标记的 siRNA。反应产物中含有三种物质:游离锝(未被亚锡离子还原的99TcmO4-)、水解锝(99TcmO2·n H2O)和99Tcm-siRNA。使用丙酮作展开剂时,游离锝的 Rf为0.9～1.0,水解锝和络合锝的Rf为0～0.1;使用生理盐水作展开剂时,水解锝的R f为0～0.1,游离锝和络合锝的 R f为 0.8～1.0。经计算得到:99Tcm-siRNA的标记率大于73%,放化纯度大于92%,比活度达1.85 TBq/g。

图2 RNA相对分子质量质谱分析a——耦联前;b——耦联后

3.2 hTERT蛋白抑制实验

蛋白印迹法比较未转染肿瘤细胞、转染脂质体肿瘤细胞、转染未标记实验组siRNA肿瘤细胞和转染实验组99Tcm-siRNA肿瘤细胞的hTERT蛋白表达水平。h TERT蛋白抑制实验示于图3。由图3结果计算可知,hTERT靶向的实验组siRNA对hTERT蛋白表达具有显著的抑制效果,以β-tubulin管家蛋白为参照,转染未标记实验组siRNA的肿瘤细胞中蛋白抑制率为(76.32±3.43)%,转染实验组99Tcm-siRNA的肿瘤细胞中蛋白抑制率为(76.78±2.95)%,二者无统计学差异(P ＞0.05)。与未转染和仅转染脂质体的肿瘤细胞相比,转染实验组99Tcm-siRNA的细胞其蛋白表达量的平均抑制率为76.7%。

蛋白抑制结果显示,siRNA探针在耦联NHS-MAG3和标记99Tcm后的干扰活性无明显改变,说明 siRNA反义链5'端连接的六碳己基、氨基、MAG3基团的耦联及99Tcm的标记未影响siRNA分子的干扰活性以及靶向结合能力。这可能由于采用2'-OMe修饰siRNA能够提高其核酸酶抵抗力,并降低激发免疫反应、脱靶效应的可能性[5],NHS-MAG3基团的相对分子质量小、结构简单,对标记分子的空间构型、结合区域、活性位点的影响小,保证了探针的生物活性[6]。

3.3 生物分布

99Tcm标记的实验组siRNA和对照组siRNA在各组织的放射性分布结果分别列于表1和表2。对比表1和表2可知,两种探针在肾脏的放射性摄取在各时间点均为最高,其次为肝脏。血液的放射性分布在注射后初始较高,但是随着时间延长而迅速下降,在6 h时最低。血供丰富的脏器(例如心脏、肺脏、脾脏和骨髓)其放射性分布情况与血液类似,均随时间延长而持续降低。胃肠系统包括胃和小肠的放射性分布均不高。

图3 各组细胞的hTERT蛋白表达a——各组细胞的h TERT和β-tubulin蛋白表达结果;b——hTERT与β-tubulin蛋白的条带亮度比

表1 99 Tcm标记的实验组siRNA在荷Hep G2瘤裸鼠体内生物分布(,n=5)

组织或器官放射性摄取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h心脏 0.76±0.10 0.43±0.05 0.41±0.14 0.38±0.10 0.32±0.06肝脏 7.68±0.84 3.08±0.32 1.63±0.38 1.56±0.12 0.99±0.05脾脏 0.78±0.15 0.50±0.11 0.41±0.07 0.36±0.05 0.25±0.08肺脏 1.36±0.09 1.03±0.23 0.98±0.10 0.96±0.08 0.65±0.15肾脏 9.31±2.68 5.80±2.80 4.47±0.85 2.72±0.63 1.99±0.59胃 3.06±0.84 1.66±0.10 1.44±0.40 1.24±0.27 1.20±0.35小肠 4.20±1.93 2.77±0.76 2.10±1.24 0.95±0.41 0.64±0.07膀胱 2.60±0.78 2.08±0.33 2.39±0.41 3.42±2.30 3.56±0.49骨骼肌 0.61±0.15 0.31±0.04 0.58±0.49 0.22±0.05 0.17±0.01长骨 1.06±0.21 0.59±0.06 0.39±0.19 0.19±0.05 0.10±0.03血液 0.88±0.14 0.52±0.03 0.44±0.06 0.43±0.08 0.40±0.06肿瘤 1.08±0.07 0.82±0.16 0.71±0.14 0.74±0.15 0.97±0.15

表2 99 Tcm标记的对照组siRNA在荷Hep G2瘤裸鼠体内生物分布(,n=5)

表2 99 Tcm标记的对照组siRNA在荷Hep G2瘤裸鼠体内生物分布(,n=5)

组织或器官放射性摄取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h心脏 0.68±0.37 0.34±0.09 0.27±0.07 0.16±0.02 0.18±0.05肝脏 4.22±0.94 2.20±0.92 1.27±0.32 0.88±0.12 0.49±0.15脾脏 1.68±0.66 0.51±0.23 0.38±0.12 0.27±0.04 0.13±0.08肺脏 1.13±0.44 0.76±0.10 0.48±0.13 0.23±0.08 0.22±0.04肾脏 10.17±3.86 8.20±1.61 5.74±1.90 2.14±0.86 1.85±0.58胃 0.87±0.35 2.21±0.72 1.41±0.50 0.86±0.24 0.52±0.21小肠 1.66±0.72 0.80±0.05 0.41±0.13 0.25±0.04 0.23±0.02膀胱 2.83±0.78 1.77±0.76 0.32±0.09 0.22±0.11 0.28±0.17骨骼肌 1.18±0.36 0.31±0.07 0.21±0.08 0.11±0.04 0.08±0.02长骨 1.01±0.71 0.35±0.03 0.24±0.04 0.19±0.00 0.14±0.05血液 2.55±0.81 0.93±0.36 0.56±0.17 0.33±0.02 0.33±0.14肿瘤 1.88±0.05 0.66±0.19 0.43±0.09 0.27±0.04 0.16±0.06

由表1可见,注射99Tcm标记的实验组siRNA探针后,肿瘤的放射性分布在0.5 h时低于血液和其他脏器。但在1 h后,肿瘤的放射性分布随时间延长而逐渐增加,由(0.82±0.16)%ID/g增加至(0.97±0.15)%ID/g。相比之下,血供丰富的脏器其放射性分布均随时间延长不断降低,特别是血液的分布降低较快。可见,实验组 siRNA在肿瘤部位的滞留保持稳定的水平。注射后0.5 h左右,放射性探针的生物分布主要反映的是在血池相的分布,属于非特异性,因而血液及供血丰富的脏器其放射性分布较高。随着时间延长,血液中的标记探针逐渐与肿瘤靶点结合,导致探针在肿瘤的分布逐渐增加,而在其他脏器逐渐降低。

由表2可见,注射99Tcm标记的对照组siRNA后,肿瘤的放射性分布随时间延长而不断降低,0.5 h时为(1.88±0.05)%ID/g,到6 h时仅为(0.16±0.06)%ID/g。其他脏器的放射性分布也呈现下降趋势,可见对照siRNA在肿瘤中的分布和其他脏器的分布相近,无明显特异性。

对比实验组和对照组可知,两探针在肿瘤部位的放射性分布存在显著性差异(p＜0.05)。实验组在肿瘤部位的分布不断增加,而对照组不断降低。以上结果提示,h TERT靶向的siRNA在肿瘤靶向浓聚的特异性。

实验组和对照组T/NT分别列于表3和表4。表3和表 4显示,除肝脏、肺脏、小肠骨骼肌外,实验组和对照组探针在其他组织的T/NT 6 h内均有显著性差异(p＜0.05)。在注射实验组探针后第6 h时,所有脏器的T/NT均显著高于对照组(p＜0.05),其肿瘤与血液和肿瘤与骨骼肌的T/NT分别为2.62±0.70和6.02±0.52,相比之下,对照组的肿瘤与血液的T/NT在注射后各时间点均未超过1.00。

表3 99 Tcm标记的实验组siRNA注射后6 h内的T/NT(¯x±s,n=5)

表4 99Tcm标记的对照组siRNA注射后 6 h内的T/NT(¯x±s,n=5)

以上结果提示,99Tcm标记的实验组siRNA探针在体内十分稳定,且在肿瘤部位显示出浓聚效果,其清除速率比血液清除慢,使得肿瘤的靶本底增加,说明siRNA探针具有在体内特异性靶向结合的能力。

作为小分子水溶性探针,siRNA在肾脏、尿液的分布较高,可能是由于肾脏近曲小管对核酸分子强烈的重吸收作用而导致[7]。肾脏的清除速度较肝脏快,迅速降低本底以提高探针的靶与本底的放射性之比,有利于靶向示踪,特别是靶向显像,但这同时限制了核酸探针在泌尿系统或肝脏肿瘤的示踪应用。随着显像时间延长,肝、肾的放射性分布逐渐减低,而肿瘤的放射性相对稳定,从而提高了肿瘤与非肿瘤部位的放射性摄取比。因此,双时相或者延迟采集法可以提高靶与本底的放射性之比[8]。

4 结 论

本研究通过体外基因干扰活性和体内生物分布实验,证明99Tcm标记的siRNA探针在体外和体内均具备与靶向基因结合的特性。99Tcm标记实验组siRNA探针不仅能够与活体h TERT表达阳性的肿瘤特异性地结合,而且可以对siRNA探针的体内分布进行实时、无创、动态的示踪。因此,99Tcm标记的siRNA探针对活体肿瘤示踪具有良好的研究前景和潜在的应用价值。

致谢:感谢 Hnatowich教授赠与NHS-MAG3。

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