配伍对化瘀通脉方中丹参在大鼠体内的药动学影响*

王 萍 ，王 洋 ，，李 进 ，陈 涛 ，郑蓓蓓

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

配伍对化瘀通脉方中丹参在大鼠体内的药动学影响*

王 萍1，王 洋1，2，李 进2，陈 涛2，郑蓓蓓1

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

[目的]研究化瘀通脉方在大鼠体内的动力学特征及其不同配伍对组方中有效成分在体内吸收、分布和代谢的影响。[方法]采用 Irregular-HC18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，流动相甲醇－1%冰醋酸（40∶60），柱温 30℃，波长280 nm，测定灌胃化瘀通脉方及其不同配伍组方后的大鼠血浆和组织中的药物浓度，Kinetica 5.0软件对数据进行统计分析。[结果]建立了同时测定大鼠血浆及组织样品中丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛和阿魏酸四种成分的高效液相色谱（HPLC）法，该方法的精密度、稳定性及回收率等均符合要求，线性关系良好。[结论]配伍对化瘀通脉方中丹参素在大鼠体内吸收、分布和代谢均具有积极的影响。

化瘀通脉方；丹参；配伍；药动学；组织分布

多年的临床研究证明化瘀通脉方有确切的临床疗效，主治心悸、真心痛、胸痹、中风偏瘫等以“瘀”证为主的疾病。全方由4味药组成：丹参、鸡血藤、当归、川芎。方中丹参祛瘀止痛，活血通络，为君药。鸡血藤补血活血通络，当归补血活血，调经止痛，两药合用，共助君药活血通络，祛瘀止痛，又可补血达祛瘀而不伤正之功，为臣药。川芎活血行气，祛风止痛，为血中之气药，既可助君以活血行气，通络止痛，又以其辛温走窜之性，使诸药速达病所，为佐使药。全方药味精专，刚柔相济，动静相伍，祛瘀而不伤正，切中病机，力专而效著。

丹参素、丹酚酸B和原儿茶醛为君药丹参的主要药效成分，而阿魏酸则为臣药当归和佐使药川芎的共有药效成分。因此本研究以丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛和阿魏酸为检测指标，运用现代药物分析手段对口服给予化瘀通脉方后在大鼠体内的药代动力学进行研究，旨在探讨方中主要有效成分在体内的吸收、分布和代谢规律，为临床用药提供依据。

1 材料

1.1 仪器 岛津LC-20A型高效液相色谱（HPLC）仪，紫外检测器，TGL-16台式高速离心机（上海医用分析仪器厂），XW-80A微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），N-EVAPTM 111氮吹仪，P30TC空气泵（美国）。

1.2 药品和试剂 丹酚酸B标准品（批号：111562-200605），丹参素标准品（批号：110855-200504），原儿茶醛标准品（批号：110810-200506），阿魏酸标准品（批号：110773-200611），以上标准品均为中国药品生物制品检定所提供。药材丹参、当归、鸡血藤和川芎均购于安国药材基地，由天津中医药大学生药教研室马琳教授鉴定。甲醇（色谱纯）、丙酮、冰醋酸（分析纯），肝素钠注射液，水为纯净水。

1.3 实验动物 雄性Wistar大鼠80只，体质量（200±10）g由中国医学科学院实验动物研究所提供，许可证编号：SCXK（京）2009-0004。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱为Irregular-H C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-1%冰醋酸（40∶60），流速1mL/min，柱温30℃，检测波长280 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取丹参素3.90mg，原儿茶醛2.03mg，阿魏酸2.10mg，丹酚酸B 6.16mg，分别用50%甲醇溶解，并定容至10mL作为标准储备液。

精密量取以上4种标准储备液各2mL至同一10mL量瓶中，用50%甲醇稀释定容至刻度作为混合标准品溶液。再用50%甲醇依次稀释成7个系列浓度，备用。

2.2.2 灌胃药液的制备 君药（君药组）：丹参50 g。君药+臣药（君臣组）：丹参 50 g，当归 50 g，鸡血藤100 g。化瘀通脉方（全方组）：丹参50 g，当归50 g，鸡血藤100 g，川芎50 g。

将以上3组灌胃药分别加10倍量水浸泡0.5 h，回流提取2次，第1次1.5 h，第2次1 h，滤过药渣，合并两次滤液浓缩至100mL药液，80%乙醇醇沉24 h，减压浓缩回收乙醇，定容至100mL，4℃冷藏，备用。

2.3 血浆样品及组织样品采集与前处理 将30只健康大鼠按随机数字表法随机分为3个给药组，即君药组、君臣组、全方组，每组10只。再将每个给药组分为5个平行实验组，每组2只交叉取血。给药前禁食12 h，自由饮水。按10mL/kg的剂量灌胃给药，分别于给药前及给药后 0.167、0.333、0.50、0.75、1.0、1.5、3.0、5.0、8.0 和 12 h 从大鼠眼眶后静脉丛取血约0.5mL，至肝素抗凝管中，6000 r/min离心10min，分离血浆，于-20℃保存，待用。

将48只健康大鼠随机分为2个给药组，即君药组和全方组，每组24只。再将每个给药组分为3个平行实验组，每组8只。给药前禁食12 h，自由饮水。按10mL/kg的剂量灌胃给药，分别于给药前及给药后 0.167、0.333、0.50、0.75、1.0、1.5、3.0 和 5.0 h 从大鼠眼眶后静脉丛取血约0.5mL，脱臼处死，排除瘀血，取出心脏和全脑，用生理盐水洗净表面瘀血，剥离大脑表面血管膜，吸干表面水分，称质量，加入2倍量生理盐水，充分匀浆。于-20℃保存，待用。

分别取大鼠血浆和组织匀浆液200μL置于10mL具塞离心管中，加入丙酮400μL，涡旋混合4min，10 000 r/min离心10min，准确移取上清液400μL，于45℃氮气流下吹干，残留物以100μL甲醇溶解，涡旋混合2min，12 000 r/min离心10min，取上清液进高效液相色谱系统，进样量20μL。

3 结果

3.1 方法专属性 图1为空白血样、空白血样加混合对照品溶液及实测大鼠血浆样品的HPLC图。可见，血样中的内源性物质及其他入血成分均能与待测物达到良好分离，不干扰样品的测定，丹参素、原儿茶醛、阿魏酸和丹酚酸B的保留时间分别为3.378、4.637、9.788和 19.378min 左右。

3.2 血浆样品测定结果 对大鼠灌胃君药、君药+臣药和全方后的血浆样品数据进行分析，运用Kinetica5.0软件，采用统计矩法按照非房室模型拟合以下药动学参数：最大血药浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）、药—时曲线下面积（AUC0-∞）、平均滞留时间（MRT0-∞）、半衰期（T1/2）。结果见表 1～4。

表1 君药、君药+臣药和全方给药丹参素药动学参数（±s,n=5）Tab.1 Pharmacokinetic parametersof Danshensu in rat plasma（±s,n=5）

表1 君药、君药+臣药和全方给药丹参素药动学参数（±s,n=5）Tab.1 Pharmacokinetic parametersof Danshensu in rat plasma（±s,n=5）

组别Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君药 41.38±10.87 0.167±0.074 542.7±103.6 13.81±2.984 9.320±2.245君药+臣药 41.13± 9.432 0.167±0.000 521.7± 93.83 13.33±2.746 9.004±2.819全方 49.87±11.44 0.167±0.074 678.3±121.50 14.55±2.537 9.743±2.459

表2 君药、君药+臣药和全方给药丹酚酸B药动学参数（±s,n=5）Tab.2 Pharmacokinetic parametersof Salvianolic acid B in rat plasma（±s,n=5）

表2 君药、君药+臣药和全方给药丹酚酸B药动学参数（±s,n=5）Tab.2 Pharmacokinetic parametersof Salvianolic acid B in rat plasma（±s,n=5）

组别Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君药 71.78±12.83 0.167±0.074 299.3±105.3 5.840±1.328 4.388±0.887君药+臣药 73.16±11.49 0.167±0.000 370.9±104.8 6.303±1.527 4.500±0.693全方 86.61±16.67 0.333±0.075 554.6±110.4 8.968±2.095 6.478±1.027

表3 君药、君药+臣药和全方给药原儿茶醛药动学参数（±s,n=5）Tab.3 Pharmacokinetic parametersof Protocatechuic aldehyde in rat plasma（±s,n=5）

表3 君药、君药+臣药和全方给药原儿茶醛药动学参数（±s,n=5）Tab.3 Pharmacokinetic parametersof Protocatechuic aldehyde in rat plasma（±s,n=5）

组别Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君药 5.160±1.253 0.333±0.000 9.688±2.683 7.124±2.044 5.046±0.849君药+臣药 5.232±1.421 0.333±0.000 17.56±4.837 7.571±1.921 5.307±0.667全方 6.861±1.378 0.333±0.000 33.16±7.639 11.70±2.473 8.263±1.259

表4 君药、君药+臣药和全方给药阿魏酸药动学参数（±s,n=5）Tab.4 Pharmacokinetic parametersof Ferulaic acid in rat plasma（±s,n=5）

表4 君药、君药+臣药和全方给药阿魏酸药动学参数（±s,n=5）Tab.4 Pharmacokinetic parametersof Ferulaic acid in rat plasma（±s,n=5）

注：“-”表示君药中未检测到阿魏酸。

组别Cmax（mg/L)Tmax（h）AUC0-∞（mg·h/L）MRT0-∞（h）T1/2（h）君药 - - - - -君药+臣药 1.793±0.382 0.167±0.074 3.155±1.742 6.612±2.468 5.007±1.092全方 1.345±0.288 0.333±0.075 8.098±1.985 9.409±2.882 6.805±1.857

3.3 组织样品测定结果 对大鼠灌胃君药和全方后的脑组织和心组织样品进行测定，采用随行标准品定量。从8个时间点中选取了6个具有代表性的时间点进行数据分析，将丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛和阿魏酸在组织中的药物浓度与血浆中的药物浓度相比，得到浓度的比值C/C’（脑血比或心血比）作为纵坐标，大鼠处死的时间作为横坐标，对以上4种有效成分在体内的分布规律进行比较，结果见图 2、图 3。

4 讨论

4.1 血浆药动学参数比较 本研究将大鼠灌胃给予君药、君药+臣药、全方（含有的相同成分生药量相等）后的血浆样品的药动学参数经非房室模型拟合，得到以下丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛和阿魏酸的药动学特征变化规律的比较。

结果表明：丹参素、丹酚酸B和原儿茶醛吸收入血的速度均较快，而在体内消除速率为丹参素<丹酚酸B<原儿茶醛，其中丹参素在体内维持药效的时间较长。君药仅与臣药配伍对以上3种成分在体内的吸收和消除速率没有影响。而全方配伍后，丹参素稍有延缓消除的趋势，吸收入血量增加；丹酚酸B的吸收和消除速率减慢，吸收入血量明显增加；原儿茶醛的吸收和消除速率明显减慢，吸收入血量增加。使药的加入同时延缓了阿魏酸的吸收和消除速率，延长阿魏酸在体内的持续作用时间。臣药当归和使药川芎中虽都含有阿魏酸，但使药的加入并没有使阿魏酸在体内的药物浓度迅速增加，而是缓慢地增加和缓慢地消除，大大提高了阿魏酸在体内的药物浓度。这很有可能与君药丹参中丹参素、丹酚酸B和原儿茶醛3种有效成分在化瘀通脉方中药效作用增强，体内作用时间延长有关。

4.2 组织分布规律比较 结果表明：丹参素是丹参中进入体内分布的主要药效成分，同时也确证了丹参作为活血药能在心-脑系统发挥疗效的临床经验。丹参素在体内的大量分布一方面与其在血液循环中的浓度较高有关，另一方面可能与丹酚酸B不稳定，在体内转化为丹参素有关[1]。而全方中的丹参素在脑组织和心组织中消除非常缓慢，在5 h左右仍保持很高的浓度，说明全方配伍能延缓丹参素在体内的消除，这可能与川芎引药上行的作用有关。丹酚酸B口服给药后在体内很不稳定，容易发生转化，影响吸收，因此考虑对于单独使用丹酚酸B制剂时应采用注射给药，以保证药效。有研究[2]表明灌胃原儿茶醛单体比丹参水提物中原儿茶醛的吸收入血量高，从而提示水提液中其他成分影响原儿茶醛分布，而本研究发现全方配伍后，延缓了原儿茶醛的体内消除，同时吸收入血量也有增加，但是全方中原儿茶醛在脑组织分布的药量反而降低，怀疑是某些配伍成分对原儿茶醛透过血-脑屏障有阻碍作用。在脑组织中未检测到阿魏酸，说明阿魏酸不能透过血-脑屏障，这与文献报道[3]相符。本研究仅仅是对化瘀通脉方体内药动学方面一个初步探索，更加深入的配伍机制研究将在后续的工作中进行。

[1]潘桂湘,张伯礼,高秀梅.大鼠灌服复方丹参方后血清中丹参素的测定[J].中国中药杂志,2003,28(6):562-565.

[2]宋 敏,杭太俊,张正行.丹参提取物有效成分在大鼠体内的药代动力学和相互影响研究[J].药学学报,2007,42(3):301-307.

[3]Wang Y L,Wang LY,ChengGG,etal.Tissue distribution of ferulic acid after oral administra tion of tangkuei blood-supplementing decoction to rats[J].LishizhenMedicineandMateriamedicaResearch,2008,19(7):1800-1802.

Influence of com patibility on pharmacokinetic effectsof Danshen in Huayu Tongmaidecoction in rats

WANGPing1,WANGYang1,2,LIJin2,etal
（1.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the pharmacokineticsofHuayu Tongmaiprescription and the effectof its differentcompatibility on the absorption,distribution and metabolism of the effective components in vivo in rats.[Methods]The plasma and tissue drug levelsof ratafter intragastric administration of Huayu Tongmaiprescription were determined and its different compatibility by HPLC.Chromatographic separationwasachieved on a reversed-phase Irregular HC18column (250mm×4.6mm,5μm)at30℃,with themobile phase of methanol-1%acetic acid(40∶60).The eluentwas detected at280 nm.The resultswere analyzed by Kinetica 5.0 software.[Results]The method for simultaneous determination of Danshensu,salvianolic acid B,protocatechuic aldehyde and ferulaic acid in rat plasma and tissuewas established by HPLC.The stability,precision and recoverieswith low,middle,high concentrationswere satisfied.The linear rangeswere allgood.[Conclusion]Compatibility has the active effecton Danshen in Huayu Tongmaiprescription.

Huayu Tongmaiprescription;Danshen;compatibility;pharmacokinetics;tissue distribution

R284.2

A

1672-1519(2011)03-0244-04

国家自然基金面上项目（30672664）。

王 萍（1981-），女,硕士，助理实验师,从事生物药剂学与药代动力学研究。

2011-02-24）