PDIA3在腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜中的蛋白表达及其意义

马丽娟 吕 宾* 孟立娜 范一宏 金海峰

浙江中医药大学附属第一医院消化内科（310006）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome,IBS）是以腹痛或腹部不适并伴有排便异常为特征的一种功能性肠病[1]。目前IBS的发病机制尚未完全阐明，其可能的病理生理机制包括肠道动力异常、内脏高敏感、脑-肠轴相互作用、炎症、肠道神经-免疫-内分泌网络调控失常等，其中内脏敏感性增高是其特征性的主要病理生理基础[2]。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）是一种主要存在于哺乳动物和酵母内质网腔的多功能蛋白，PDIA3是该家族中巯基蛋白氧化还原酶的重要组分。本课题组的前期研究[3]发现内脏高敏感大鼠模型结肠组织中PDIA3蛋白表达上调，但其在腹泻型IBS（IBS-D）患者结肠黏膜中的蛋白表达及其意义尚不清楚。本研究通过检测PDIA3在IBS-D患者结肠黏膜中的蛋白表达变化，旨在初步探讨其在IBS发病机制中的作用。

材料与方法

一、患者来源

选取2009年2～8月至浙江中医药大学附属第一医院消化内科就诊的IBS-D患者15例，诊断符合罗马Ⅲ标准[1]。其中男6例，女9例；年龄23～72岁，平均48.6岁；病程1～15年，中位病程 6.2年。同时排除符合下列标准者：①腹腔疾病、感染性肠炎、内分泌和中枢神经失调、胃肠道肿瘤患者；②就诊前一个月内服用抗过敏药、促胃肠动力药、非甾体消炎药、神经精神类药物等的患者。选取同期主动要求行结肠镜检查的健康体检者15例作为对照，其中男7例，女8例；年龄25～70岁，平均48.1岁。两组性别构成比、年龄差异无统计学意义（P>0.05）。

采用随机数表法将IBS-D组和对照组患者进行编号，分别表示为I1～I15和N1～N15。所有研究对象均知情同意。

二、主要试剂和仪器

蛋白浓度测定试剂盒（Bio-Rad公司）；预染蛋白质 Marker（Fermentas）；丽春红染液、变性蛋白质上样缓冲液（碧云天生物技术研究所）；牛血清白蛋白（华美生物工程有限公司）；PDIA3一抗（Cell Signaling Technology）；β-actin 一抗（武汉博士德生物工程有限公司）；二抗（明睿生物技术有限公司）；增强型化学发光（ECL）显色剂（Santa Cruz公司）；人肥大细胞类胰蛋白酶ELISA检测试剂盒（R&D Systems,Inc）。

SpecTM 3000紫外分光光度仪、PowerPac Basic电泳仪、Gel Doc 2000紫外凝胶成像分析系统（Bio-Rad 公司）；ELX808酶标仪（BioTek公司）。

三、方法

1.取材和处理：所有研究对象均接受结肠镜检查，回盲部取黏膜组织3块，其中1块以0.9%NaCl溶液漂洗3次，液氮保存，用于蛋白印迹法检测PDIA3蛋白表达；其余2块组织-80℃冰箱保存，用于ELISA法检测类胰蛋白酶浓度。

2.蛋白质印迹法检测PDIA3蛋白表达：取结肠黏膜组织，加入RIPA裂解液匀浆、混匀后冰浴30 min；4℃ 12000 r/min离心5 min，收集上清液；DC法测定蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳，转膜、封闭后，加入PDIA3和β-actin一抗（工作浓度为 1∶1000），4 ℃过夜；TBST 洗 10 min×3 次，加二抗（工作浓度为 1∶1000），室温 1～2 h；TBST 洗10 min×3次。ECL发光自显影。凝胶成像系统成像，应用Quantity One软件对条带进行半定量分析。结果以目的条带与内参照β-actin条带的积分光密度的比值表示。

3.类胰蛋白酶浓度测定：取2块活检标本称重后以0.9%NaCl溶液漂洗，置于1 ml HBSS平衡盐液中，37℃孵育1 h，分离上清液[4]。采用ELISA法测定类胰蛋白酶浓度，具体步骤参照试剂盒说明书操作。应用标准品制作标准曲线，每组标准品和样品重复2次，取均值。

四、统计学分析

结 果

一、PDIA3蛋白表达

蛋白质印迹法示IBS-D患者结肠黏膜PDIA3蛋白表达显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）（见表 1、图 1）。

二、类胰蛋白酶浓度

ELISA法示IBS-D患者结肠黏膜组织类胰蛋白酶浓度显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）（见表 1）。

表1 IBS-D组和对照组PDIA3蛋白表达和类胰蛋白酶浓度比较（ ）

表1 IBS-D组和对照组PDIA3蛋白表达和类胰蛋白酶浓度比较（ ）

*与对照组比较，P<0.01

组 别 例数 PDIA3蛋白表达 类胰蛋白酶（μg/g组织）IBS-D 组 15 1.20±0.33* 0.059±0.026*对照组 15 0.83±0.21 0.023±0.017

三、PDIA3蛋白表达与类胰蛋白酶浓度的关系

对照组PDIA3蛋白表达与类胰蛋白酶浓度无关（r=0.208，P=0.803），而 IBS-D 组患者 PDIA3 蛋白表达与类胰蛋白酶浓度呈正相关（r=0.750，P=0.003）。

图1 IBS-D患者和对照组结肠黏膜PDIA3蛋白表达的电泳图

讨 论

PDI是一种多功能蛋白，能催化形成二硫键，具有分子伴侣活性[5]。PDI家族是一类在内质网中起作用的巯基-二硫键氧化还原酶，属折叠酶。其主要职能是催化内质网中新生肽链的氧化折叠，并在内质网相关的蛋白质降解途径、蛋白质转运、钙稳态、抗原呈递、病毒入侵等方面亦起重要作用。PDI为应激相关蛋白[6]，易被应激诱导产生。有研究[7]显示缺氧内皮细胞中PDI含量及其mRNA水平均有所升高，从而通过减弱内皮细胞活力促使内皮细胞适应缺氧环境。PDIA3为PDI家族成员之一，又称ERp57，属内质网应激信号通道蛋白。PDIA3与机体免疫密切相关，Antoniou等[8]发现在MHC分子抗原呈递的过程中，PDIA3分子直接进入MHCⅠ类分子的肽结合槽中并与其结合，然后与免疫原性多肽结合并呈递至CD8+T细胞，使T细胞活化，特异性地直接杀伤被感染的细胞。

IBS可以认为是一种应激障碍，应激导致下丘脑和其他相关脑区释放促肾上腺皮质素释放因子（corticotropin releasing factor,CRF），刺激结肠运动功能，产生超敏[9]。心理应激可直接影响肠道动力以及内脏感觉，使结肠运动、分泌功能失调，从而引起或加重IBS症状。80%的IBS患者有影响其症状发作或加重的精神因素，尤其以焦虑和抑郁的影响最为明显[10]。IBS患者存在免疫异常，有研究证实IBS患者结肠黏膜中存在T细胞浸润和肥大细胞活化，可产生细胞因子、组胺、蛋白酶[11]。Cremon等[12]亦发现IBS患者体内CD8+T细胞和肥大细胞计数增高。Ding等[3]的研究发现应激引起的内脏高敏感大鼠模型结肠组织中PDIA3蛋白表达上调，提示PDIA3过表达与结肠黏膜异常免疫应答有关，PDIA3可能为导致细胞内免疫反应信号转导级联放大反应中的某个重要蛋白分子。本研究中，IBS-D患者结肠黏膜PDIA3蛋白表达较对照组明显增加，提示其可能参与了IBS-D患者结肠黏膜的异常免疫应答。

肠道肥大细胞位于黏膜血管、淋巴和神经附近，既具有免疫活性，又能分泌多种介质，是肠道主要的抗原感受器，参与肠黏膜的免疫调节。肥大细胞在IBS的发病机制中具有重要作用，多项研究[13,14]证实IBS患者回盲部肥大细胞数量明显高于对照者，尤其是在腹泻型患者中[15]。当某种抗原刺激机体免疫系统，可引起感觉神经末梢兴奋以及信号传递，并诱导机体产生IgE抗体。抗原与抗体结合可引起肥大细胞活化、脱颗粒，并释放多种生物活性介质如类胰蛋白酶、组胺、5-羟色胺、前列腺素等，其中类胰蛋白酶几乎是肥大细胞分泌颗粒所特有的中性蛋白酶，是肥大细胞活化和脱颗粒的特异性标记[16]。类胰蛋白酶是蛋白酶激活受体-2（PAR-2）的强激活剂，而PAR-2的活化与内脏高敏感密切相关[17,18]。临床研究[4]发现IBS患者结肠胰蛋白酶、类胰蛋白酶表达以及蛋白水解活性增加，其上清给予小鼠灌肠后可通过激活PAR-2引起内脏高敏感。国内有研究[19]提示IBS-D患者升结肠黏膜肥大细胞数量和类胰蛋白酶含量均明显增加，且其结肠黏膜孵育上清液可导致小鼠内脏感觉过敏，提示类胰蛋白酶可能参与IBS-D患者内脏敏感性的改变。本研究结果显示IBS-D患者回盲部黏膜孵育上清液类胰蛋白酶浓度显著高于对照组，并与PDIA3蛋白表达呈正相关，提示IBS-D患者结肠黏膜PDIA3过表达可能促进了肥大细胞的活化并释放类胰蛋白酶，导致内脏敏感性增高。

综上所述，IBS-D患者结肠黏膜PDIA3蛋白表达上调可能是机体对应激的适应性反应，同时亦可能促进了肥大细胞的活化并释放类胰蛋白酶，从而导致内脏敏感性增高。但其具体途径尚需进一步研究证实。

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