预处理激光照射足三里穴对白细胞减少症的免疫调节影响

舒天丽 杨华元

(上海中医药大学，上海市浦东新区蔡沦路1200号，201203)

中医针灸学是中华民族几千年来防病治病经验的结晶，它在治未病方面有着绝对的优势，早在《黄帝内经》中就已经提到“上工治未病”。免疫机能正常与否是决定机体的健康或疾病的关键，如果免疫机能正常就可以“防未病”“调欲病”“治已病”。影响机体免疫功能下降具有多种因素，如环境卫生、药物影响、社会和工作压力，以及个人的衣食住行、生活方式等。穴位激光照射法对免疫功能低下疾病的治疗，具有无痛、无菌、安全、易于临床施治、对于年老体弱和惧针者更为适宜的优势。预处理的治疗方式在改善和提高免疫功能低下的同时，在其他方面也有诸多优势，如减少医疗费用和药物对机体的毒副作用等，并可提高治疗后的康复速度，所以探索有效的提高免疫功能的预处理治疗方法，是当今重要的医学研究课题，也是中医治病救人的预防医学精神的体现。

1 实验材料

新西兰种雄性大白兔20只，体重(2.8±0.2)kg，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证编号:SCXK(沪)2009-0018，于上海宝牧实验动物养殖场购买;上海中医药大学实验设施使用许可证编号:SYXK(沪)2009-0069。所有动物在同等标准环境内养育，给以自然饮水和饮食，适应实验环境1周。根据体重将兔编号，按照SAS9.0产生的随机数字表将20只兔随机分为2组，穴位照射预处理组(预处理组)和假照射对照组(对照组)，每组10只。

2 实验方法

2.1 试剂和仪器 环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)(0.2g)，购自德国Baxter Oncology GmbH公司。自行研制一台2路810nm低强度10mW激光照射治疗仪。810nm低强度、持续波激光通过光纤输出聚合照射于穴位。激光输出端与动物皮肤之间距离始终保持实验过程中干预的一致性。2路激光照射治疗仪保持双侧足三里穴同时照射45s的一致性。

2.2 造模 穴位照射预处理组实验共15d，包括造模前预处理治疗、造模、造模后假照射3个阶段:第1～5d进行造模前干预，提高机体免疫功能，干预方法为激光(波长 810nm，功率 10mW，持续波)同时照射双侧足三里穴［1］2 次/d，45s/次(4J/cm2)，2 次照射间隔时间3h;第6～10d进行动物造模，造模方法参照文献［2］，2组通过兔耳缘静脉注射环磷酰胺复制白细胞(WBC)减少症模型。每0.2g环磷酰胺加10mL生理盐水。75%乙醇棉球消毒兔耳缘皮肤，将环磷酰胺溶液(2.5mL/kg体重)缓慢推入兔耳缘静脉，隔天注射，共3次，让兔体重减轻，身体虚弱，WBC计数正常范围为7×109～13×109/L，直至WBC数量下降至低于注射前的60%，并能保持5～6d白细胞减少症的现象，作为造模成功的标志。第11～15d进行造模后假激光照射，将激光置于双侧足三里穴，但不进行照射(2次/d，45s/次，2次间隔时间 3h)。对照组实验共 10d，包括造模、造模后假照射2个阶段:第1～5d动物造模，方法同预处理组;6～10d进行假激光照射。2组照射前及随后3h测量动物白细胞计数，进行当天的第2次穴位照射或假照射。各组在假照射期间的第5d，测完第2次白细胞计数后，加测T、B淋巴细胞比值。

2.3 测外周血WBC计数方法 安静环境中，室温22℃，将兔固定于兔架上，耳廓背面剪去毛发以备采血，用手术灯照射耳部，使血管扩张便于取血。75%乙醇棉球耳缘静脉区消毒后，用一次性静脉输液针耳缘静脉放血，一次性微量吸管采血20μL，放入量杯摇匀后，滴入溶血素4滴再摇匀，用血球计数仪测WBC计数。预处理组WBC计数检测为:1)实验开始前，检测动物正常WBC计数，测后造模;2)造模期间(共5d)的第3、5d注射环磷酰胺之前再测;3)造模后期(即造模后，共5天)，每天假照射前后采血检测(包括当天首次治疗前和3h后再次治疗前)。对照组WBC计数测定时间为:1)实验开始前，检测动物正常WBC计数，测后造模;2)造模期的第3、5d注射环磷酰胺之前测定;3)造模后期，每天假照射前后采血检测(包括当天首次治疗前和3h后再次治疗前)。

2.4 测外周T和B淋巴细胞方法 测完第2次WBC计数后，测 T、B淋巴细胞比值。安静环境中，室温22℃，75%乙醇棉球耳缘静脉区消毒后，从耳缘静脉用一次性注射器抽取0.8mL血置于含有抗凝剂的离心管中，用流式细胞仪测T、B淋巴细胞。

表1 预处理组与对照组在不同时间点的WBC计数比较(¯x±s，G/L)

表2 同组家兔不同时间点的WBC比较(¯x±s，G/L)

图1 预处理组与对照组间WBC计数的比较

图2 2组之间CD3+T淋巴细胞与CD19+B淋巴细胞构成比较

2.5 统计学方法 使用SPSS17.0统计软件包，若数据服从正态分布，则采用¯x±s表示;若数据不服从正态分布，则采用中位数、最小值、最大值(M，min，max)表示。统计推断:1)WBC计数结果采用重复测量(Repeated Measures)数据资料的方差分析;2)T、B淋巴细胞的结果采用单因素方差分析(One-way Anova)，组间多重比较用LSD(方差齐时)或Dunnett T3(方差不齐时)。

3 结果

3.1 排除标准 建立WBC低下模型过程中，动物因为WBC低下，模型动物免疫功能衰弱易生病，感冒，泄泻。故预处理组中，2只动物因拒食和感冒均被排除实验。对照组中3只动物也因感冒，泄泻和不明原因死亡均被排除实验。

3.2 穴位照射预处理对WBC计数的影响 采用重复测量数据资料的方差分析，统计结果显示，预处理组WBC计数与对照组有统计学差异(F=11.786，P＜0.001)，各时间点之间差异有统计学意义(F=181.977，P＜0.001)，进一步多重比较结果见图1和表1。由图1和表1可知，预处理组与对照组第1～5天在不同时间点上的WBC计数比差异有统计学意义(P＜0.01)。

3.3 穴位照射预处理对不同时间点的外周血WBC计数的影响 同组不同时间点的WBC计数比较见表2。由表2可看出，2组造模后5d时间内的WBC计数与造模前WBC计数相比有显著差异(P＜0.01)，其对照组在5d时间内未恢复正常WBC水平范围(7×109～13×109/L)，提示造模成功。预处理组1～5d WBC计数与造模后首测相比，WBC计数连续的增多，保持极显著性差异(P＜0.01)，说明有减少免疫损伤的作用，显示免疫系统功能从造模后开始而连续5d继续向康复水平改善的过程。预处理组在3d假照射前WBC计数就已恢复到正常范围(7×109～13×109/L)。对照组与造模后首测自相对比，1d、2d WBC计数无统计学意义，在第3d才有统计学意义(P＜0.05)，提示动物受到环磷酰胺的毒害损伤，使免疫功能恢复相对缓慢，而未恢复到正常WBC水平范围(7×109～13×109/L)。说明，穴位照射预处理有减少免疫损伤，缩短康复时间的功效。

3.4 穴位照射预处理对外周T、B淋巴细胞百分比含量比较的影响 由表3、图2可知，造模后5d，预处理组与对照组相比CD3+T细胞显著增多，差异具有极显著性(P＜0.01);CD19+B细胞显著降低，差异有显著性意义(P＜0.05)。预处理组与对照组相比T/B细胞的比值向正常范围回升。

表3 外周血CD3+T、CD19+B淋巴细胞百分比含量(x¯±s)

4 讨论

本实验采用环磷酰胺减低WBC指标作为免疫功能低下动物模型。环磷酰胺造模方法简单易行，用量及时间可灵活掌握，故是常用的经典性制造免疫功能低下实验模型的方法。本研究观察外周WBC计数在穴位预处理照射中的免疫作用，发现预处理组照射足三里穴在造模后阶段有使WBC计数增多的显著作用，并缩短了康复时间，WBC数目在第3天已恢复到正常范围(7×109～13×109/L)。同时，对照组WBC计数也天然增多，但并未恢复到正常范围之内，也未恢复到该组造模前的WBC计数水平。预处理组与对照组相比，T细胞显著增多(P＜0.01)，B细胞显著降低(P＜0.05)，T/B细胞的比值回升。在造模后第5d，预处理组的T/B细胞的比值已回升到正常范围，表明预处理“足三里”能刺激T细胞的生长、B细胞的减少、调节T/B细胞的比值。

足三里穴是胃之合穴，有益脾胃、助运化、理气和血、祛邪防病的功效。中医理论认为，脾胃为后天之本，气血化生之源，阳明又为多气多血之经，所以刺激胃经合穴足三里可调气补血，是治疗疾病的关键穴位。现代研究反复证明，足三里穴有促进和调节免疫功能的作用［2-6］。所以本实验采用能双补气血的“足三里”穴，也是根据对该穴的相对特异性、以及现代免疫机制而决定的。

近年针灸界提出了“针灸预处理”一词，所谓针灸预处理，是预先对机体的某些穴位进行刺激，以提高机体的抗病与应变能力，使未来可能产生的疾病对机体组织器官和功能的损伤有减轻的作用。针灸从本质上讲，是一种物理刺激方法［7］，采用不同方法来刺激穴位都可达到激发经络之气，协调阴阳、调节机体功能的目的。预处理组的减少免疫损伤和缩短康复时间的疗效，表明足三里穴在激光预处理时，对“神经-内分泌-免疫网络”功能的调节作用，具有一定时间的延续性。从而推断，调节“神经-内分泌-免疫网络”功能的预处理，是针灸预防治疗所强调的“治未病”的治疗手段和治疗方案。有鉴于激光照射足三里有提高WBC计数的作用，故能对WBC低下而引起的许多症状有重要的良性调节作用，有利于疾病的痊愈，故穴位预处理有其“治未病”的作用。

当今世界医学的发展趋势提倡和发展预防医学。而中医针灸医学本质上是实用的临床预防医学，但到目前为止，在国际上并未得到足够的重视和广泛的应用。本实验只是对足三里穴激光预处理治疗的初步探讨，采用穴位预处理来调节机体“神经-内分泌-免疫网络”的治疗方法，应该是中医“治未病”的预防医学的重要组成部分，今后有必要进一步对针灸预处理作更深入广泛的临床研究，加以提倡。

［1］郭义.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2008，403.

［2］Sun PL，Zhou YB，Mao HJ，Wu HH，Bu LL，Sun J，Guo HY.Relationship between electroacupuncture and spleen function on leukocyte.Journal of Acupuncture and Tuina Science，2007，5(6):336-340.

［3］Trinchieri G.Biology of natural killer cells.Adv Immunol，1989，47:187-376.

［4］骆永珍.针灸与免疫［M］.北京:人民卫生出版社，2002:239.

［5］Xie L，Zhao L，Li M.Zusanli Point Injection for Treating Leukopenia Induced by Radio-Chemotherapy.Journal of Traditional Chinese Medicine，2003，23(1):59-61.

［6］Liu P，Liu Y，Tang Q.Acupoint injection plus moxibustion on postchemotherapy leucopenia.Journal of Acupuncture and Tuina Science，2006，4(2):87-89.

［7］赵立岩.经络学说在中药透皮治疗中的作用.中国针灸，1998，6:336.