注射氢水对一次性力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤的影响

李爱春 张林 周君来 孙学军

1 浙江体育职业技术学院（杭州 310012） 2 苏州大学体育学院 3 浙江工业大学 4 第二军医大学

国内外研究表明，氢气是一种优质抗氧化物质，通过呼吸氢气或饮用、注射含氢液体——氢水，可治疗缺血再灌注损伤［1-3］、神经损伤［4］、器官炎症［5，6］、药物毒性［7］、小鼠基因缺陷［8］、帕金森病［9］和人类II型糖尿病［10］等慢性氧化应激损伤，其基础是氢气的选择性抗氧化作用［1］，即选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子等导致氧化损伤重要介质的能力。而有关氢水抗氧化作用的研究刚起步，已有的研究多集中于医学实验，在体育科研领域迄今尚无涉足，有关氢水对运动性氧化应激损伤的防治研究仍属空白。本实验以骨骼肌为研究对象，探讨氢水对力竭运动大鼠氧化应激损伤的影响，为评价氢水生物学作用和运动氧化损伤防治提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 动物分组

浙江省医学科学院实验动物中心提供的30只清洁级健康雄性SD大鼠，3月龄，体重300～350g，按体重配对后随机分成安静对照组（C组）、运动对照组（E组）与运动给氢组（H组）3组，每组10只。分笼饲养，每笼2只，自由饮食饮水。饲料、智能屏障动物实验室及动物饲育管理均由浙江省医学科学院统一提供，光照时间为8:00～18:00，动物室内温度22±3℃，相对湿度为50±5%。所有动物实验前均未进行过跑台运动。

1.2 实验方案

氢水购自上海基量标准气体有限公司。氢气饱和生理盐水的制备: 在0.5 MPa压力下加压暴露4 h，将纯氢气溶解于正常生理盐水中达到饱和，4℃贮存。

C组不运动。正式实验前2天，E组和H组每天进行1次适应性低强度跑台运动（BCPT-98型电动动物跑台由杭州段式提供），坡度0，速度10 m·min-1，持续10 min。正式实验时，H组于运动前腹腔注射10 ml·kg-1体重氢水，E组腹腔注射同体积生理盐水，后采用Marra方案［11］进行一次性大强度力竭跑台运动。坡度0，初始速度10 m·min-1，10 min内增加至28 m·min-1（超过90%VO2max），持续运动至力竭。运动时使用声、光或毛刷刺激大鼠尾部以保证运动强度。力竭判定标准：运动末期动物不能坚持原跑速，先后滞留跑道后1/3处达3次以上，刺激驱赶无效，停跑后体征表现为呼吸急促，神情倦怠，腹卧位，对刺激反应迟钝。

1.3 取材与指标测试

E组和H组均于力竭运动后3 h采用股动脉放血法处死，取两侧后肢腓肠肌中段，剔除筋膜，迅速置于干冰中冷冻待测。整个取样时间约1 min。同样方法处死C组，取腓肠肌，待测。

试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，严格按试剂盒说明书进行操作。采用化学比色法测定SOD、MDA、GSH、TAOC活性，采用Elisa法测试3-硝基酪氨酸（3-NT）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）浓度。

1.4 统计学分析

用EXCEL和SPSS软件对所获得数据进行正态检验和双因素方差分析，结果以± s表示。P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨骼肌氧化应激指标

表1显示，与C组比较，E组3-NT、MDA与8-OHdG 均显著升高（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01），H组3-NT无明显变化，MDA显著低于C组（P <0.01），8-OHdG浓度显著高于C组（P < 0.05）；与E组比较，H组3-NT无显著变化，MDA、8-OHdG均显著降低（P < 0.01，P < 0.05）。

2.2 骨骼肌抗氧化酶活性

表2显示，与C组比较，E组SOD、GSH活性显著降低（P < 0.05），TAOC有所降低，但无统计学意义；H组SOD、GSH、TAOC活性与C组比较无明显差异；但显著高于E组（P < 0.01，P <0.01，P < 0.05）。

表2 各组大鼠骨骼肌抗氧化酶活性比较

3 讨论

氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加和／或清除能力降低，导致活性氧在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。氧自由基在体内具有不稳定性和较高的化学反应性，可以攻击蛋白质、脂质以及DNA等生物分子，形成一系列氧化损伤产物［12］。3-NT是活性氧存在的条件下，高毒性的过氧亚硝酸（ONOO-）使游离酪氨酸或蛋白质酪氨酸硝基化形成的稳定的终末代谢物，是蛋白质硝基化的特异性标志物，是介导氧化应激损伤作用的重要环节，是近年来细胞损伤机制研究的热点之一。研究显示，在氧化应激过程中，3-NT的产生可引起细胞内蛋白质和酶变性失活、DNA损伤、细胞死亡和凋亡［13］。MDA是脂质过氧化的最终产物，是反映体内脂质过氧化水平的敏感指标，检测MDA水平可间接反应氧化膜氧化损伤反应的程度。8-OHdG是DNA组分之一的脱氧鸟苷在活性氧作用下的特异产物，是内源性及外源性因素导致DNA氧化损伤的生物标志物［14］。在体育科研领域，MDA是运动氧化损伤防治的常用指标，而有关3-NT、8-OHdG的研究甚少。

本研究结果表明，力竭运动使骨骼肌氧自由基增加，抗氧化酶活性降低，氧化应激加强，引起骨骼肌细胞酪氨酸残基硝化、脂质过氧化与DNA羟化，导致大鼠骨骼肌蛋白质氧化、脂质过氧化与DNA损伤。氢水降低了上述损伤，对力竭运动大鼠骨骼肌氧化应激损伤具有保护作用。其保护作用的基础可能是氢水的选择性抗氧化。由于氢还原性较弱，不与信号作用、氧化作用弱的活性氧直接反应，但与活性强、毒性强的活性氧，如ONOO-与OH-直接发生反应。Gharib［5］等研究认为氢气与OH-直接反应是治疗炎症等损伤的基础。Ohsawa［1］等采用化学反应、细胞学等实验证明，氢气溶解在液体中可选择性中和氧化损伤的重要介质 — ONOO-与OH-，直接清除毒性强的氧自由基，起到自由基清除剂的作用。

本研究中，一次性力竭运动后大鼠骨骼肌SOD、GSH含量下降，可能与运动中胰高糖素、儿茶酚胺和血管加压素释放增加有关。TAOC下降可能与运动中活性氧高水平产生，血流改变、能量供应与还原态能量利用能力降低有关［15］。补充氢水组SOD、GSH与TAOC活性升高可能与氢气的特性有关。氢气具有低密度、小分子、易扩散的特性，可有效改善微循环，降低微循环阻抗，因而增加组织供氧，降低氧化应激。另一方面，由于抗氧化的源头是能源物质代谢，氢水可能参与了能量代谢，影响NAPH氧化酶的产生，发挥了信号作用［10，16］。这提示氢气可能是一种新的生物活性物质，具有广泛的应用前景。

4 总结

氢水能降低骨骼肌ONOO-、过氧化脂质类与OH-等的代谢水平，提高骨骼肌抗氧化酶活性，增强骨骼肌的总抗氧化能力，改善力竭运动大鼠骨骼肌蛋白质氧化损伤、脂质过氧化损伤及DNA损伤，对骨骼肌运动性氧化应激损伤具有保护作用。

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