银杏叶口服液微生物限度检查试验及方法学验证资料

朱晓燕

（哈药集团三精制药股份有限公司，黑龙江 哈尔滨 150000）

微生物限度检查法

取银杏叶口服液3支（规格：10ml）,共取10ml供试品，至90mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，制成 1：10、1：100、1：1000 供试液备用。

细菌数 取1：10供试液50ml用薄膜过滤法过滤。用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次冲洗100ml,共冲洗三次.冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养.若滤膜上无菌落生长,以<1乘以稀释倍数报告菌数.

霉菌数 取各稀释级供试液1ml，采用平皿法，依法《中国药典》2005年版一部附录检查，应符合规定。

控制菌取1：10供试液10ml（相当于供试品1ml）接种至100 ml相应培养基中，培养18-24小时。依《中国药典》2005年版一部附录检验，结果应符合规定。

微生物限度检查方法学验证

依据《中国药典》2005年版，对银杏叶口服液的微生物限度检查法进行了方法学验证，验证结果如下：

1 样品：银杏叶口服液

批号：10042114、10042124、10042134

生产单位：哈药集团三精制药股份有限公司

2 验证用菌种：

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F)98001]

黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]

3 验证用培养基：

营养琼脂培养基 批号：090225

玫瑰红钠琼脂培养基 批号：080905

胆盐乳糖培养基 批号：090104

营养肉汤培养基 批号：090121

改良马丁培养基 批号：090220

曙红亚甲蓝培养基 批号：090322

以上培养基均由中检所提供。

4 菌液制备：

4.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养18-24小时；

接种白色念珠菌至改良马丁培养基中，培养24-48小时。

以上菌液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成50-100CFU/ml的菌悬液，并同时进行活菌计数。

4.2 接种黑曲霉至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5-7天。用氯化钠溶液3-5ml将黑曲霉孢子洗脱至无菌试管内，再用氯化钠溶液制成50-100CFU/ml的孢子悬液，并同时进行活菌计数。

5 供试液制备：

取银杏叶口服液3支，共取供试品10ml，至90mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，制成1：10的供试液备用。(共制3份该供试液，分别供3种细菌试验用)

6 方法学验证试验：

6.1 细菌计数方法验证：

6.1.1 试验组：

取1:10的供试液50ml用薄膜过滤法过滤。用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗100ml，共冲洗三次.在最后一次冲洗液中加入50-100cfu/ml试验菌1ml，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养，测定试验组菌数。

6.1.2 菌液组：

取上述菌液1ml至平皿中，倾注营养琼脂培养基，至相应的温度培养。测定所加的试验菌数。

6.1.3 供试品对照组：

取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

6.1.4 稀释剂对照组：

用相应稀释剂和冲洗液代替供试品，按试验组的方法测定其菌数。

6.2 霉菌及酵母菌计数方法验证：

6.2.1 试验组：

取1：10供试液1ml于平皿中，再加入相应的阳性试验菌菌液1ml，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置相应温度培养，每株试验菌平行制备二个平皿，测定其菌数。

6.2.2 菌液组：

取稀释好的相应菌液1ml，方法同试验组，分别加入平皿中，加入相应培养基，置相应温度培养，测定所加的试验菌数。

6.2.3 供试品对照组：

取规定量供试液，按菌落计数法测定供试品本底菌数。

6.2.4 稀释剂对照组：

取稀释剂替代供试液，方法同试验组。

7 次验证结果见表1，2，3

7.1 控制菌检查方法验证：

7.1.1 大肠埃希菌检查方法验证

菌种：

阳性菌：大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

阴性菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

试验方法：

7.1.2 试验组：取1：10供试液10ml（相当于供试品1ml）及10-100cfu试验菌接种至胆盐乳糖培养基100 ml中，培养18-24小时。依《中国药典》2005年版一部附录检验。

7.1.3 阴性对照组：方法同试验组，加入1ml 10-100cfu阴性菌。

8 次验证结果见表4，5，6

8.1 结果：

8.1.1 计数方法验证：在三次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，试验组的菌回收率均大于70%。故可照该供试液制备法和计数法，测定银杏叶口服液的细菌数、霉菌数及酵母菌数。

a.制菌检查法验证：阴性对照组未检出阴性对照菌，试验组检出阳性试验菌，故可以照此供试液制备法和控制菌检查法进行银杏叶口服液的控制菌检查。

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[1]宋勤,杜平华.中成药微生物限度检查方法的探讨[J].中国药事，2006-01-20.