中国部分马铃薯产区马铃薯Y病毒(PVY)的株系分化与鉴定

陈士华，刘晓磊，张晓婷，吴兴泉

(1.河南工业大学，河南 郑州450001;2.河南农业大学，河南 郑州450002)

马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)是马铃薯上最常见、危害最重的马铃薯病毒之一，发病严重时减产可达80%以上.马铃薯Y病毒为正义单链RNA病毒，线状，全基因组长度在9 700 nt左右，由1个开放阅读框和其两侧的非编码区组成，可编码1个多聚蛋白，然后自身水解成至少10个蛋白质.作为RNA病毒，PVY在自然条件下极易发生基因重组

或突变而产生具有不同致病力的新株系.因此，PVY具有明显的株系分化现象.PVY已被广泛认同的株系类型有3种:PVYO株系、PVYN株系和PVYC株系.近年来，PVY在欧洲、美洲等地区陆续发现了一系列的具有高致病性的PVY新株系.主要包括PVYNTN株 系［1］、PVYNW株 系［2］、PVYN:O株 系［3］、PVYnnp株系［4］等.其中 PVYNTN株系、PVYNW株系、PVYN:O株系是侵染马铃薯的PVY株系，PVYnnp株系则是侵染辣椒的PVY株系.PVY的各种新株系不但致病力更强，而且传播更为迅速，新的流行疫区不断出现，在一些国家已经成为PVY的主流株系.PVY在中国分布广泛.目前，中国在株系水平上对PVY进行的研究已经开展，郭兴启［5］和李鹏［6］分别克隆鉴定了PVYN株系cp基因介导的烟草抗病性.王秀芳等［7］证明PVY山东分离物为PVYO株系.石鹏君［8］克隆表达了PVYN株系和PVYO株系的HC-Pro基因.目前，PVY各类新株系在中国马铃薯上的发生情况、分子特征、致病性等方面尚未见到系统的研究报道，影响了对PVY开展有效地监控措施.研究明确中国各马铃薯产区PVY的株系种类，可为制定PVY的综合防治策略提供理论依据，对促进马铃薯产业的健康发展、保证粮食生产安全具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 毒源的获得

2007—2008年间分别在山西省临县，贵州省贵阳市、威宁自治县和黑龙江省克山农场等地区采集获得感染PVY的马铃薯样本.

1.2 PVY p1基因和cp基因的克隆

1.2.1 引物的设计与合成 依据PVY cp基因和p1基因上、下游核苷酸序列，设计RT-PCR引物序列.其中PVY p1基因上游引物PVYP1序列为:5'-TCATCCATGGCAACTTACACA-3'，下游引物PVYP2序列为:5'-AACCATTGAATCCATAACCCC-3'.PVY cp基因上游引物 YCP1:5'-CACCATATGGCAAGCAAATGACACAAT-3';PVY cp基因下游引物YCP2:5'-CCATCTAGAGACACTACATCACAT-3'.引物有宝赛生物科技有限公司合成.

1.2.2 cp基因和p1基因的克隆与序列测定 采用植物RNA提取试剂盒提取带毒马铃薯样本的总RNA，以此为模板，加入随机六聚体引物在反转录酶的作用下进行反转录合成cDNA，利用上述引物，采用常规PCR法扩增cp基因和p1基因.基因克隆载体选用Promega公司的pGEM-T Easy Vector System(长3 018 bp，具有Amp抗性，可用于蓝白斑筛选).PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA胶回收试剂盒进行纯化，与pGEM-T easy Vector连接，然后采用CaCl2法将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞.选取白色菌落扩大培养后，采用碱裂解小量提取法质粒DNA进行酶切鉴定.对阳性克隆进行基因序列测定，序列测定在大连宝生物工程有限公司进行.

1.3 依据p1基因和cp基因对PVY株系进行分子鉴定

将p1基因和cp基因联合进行序列分析.从Genbank中检索获得已知株系类型的PVY全基因组序列，从中截取各分离物的p1基因和cp基因序列，并将两基因联合.然后将本研究中测定的中国各地区PVY的p1基因和cp基因联合后与上述联合基因序列共同利用Clustal X软件和BioEdit软件进行系统进化树的建立和序列特征分析，以明确各分离物的株系种类.

2 结果与分析

2.1 中国部分马铃薯产区PVY p1基因和cp基因的克隆

以带毒马铃薯叶片总RNA为模板，以随机六聚体为引物反转录合成cDNA第1链，以PVYCP1，PVYCP2和PVYP1，PVYP2为引物，PCR扩增p1基因和cp基因，转入大肠杆菌(图1-2).序列测定结果表明，利用 PVYCP1和 PVYCP2引物获得的DNA片段全长1 064 bp，其中1～798 bp为PVY cp基因，799～1 064 bp为3'非编码区序列.利用PVYP1和PVYP2引物获得的DNA片段全长852 bp，可编码282个氨基酸的蛋白质，其1～6 bp为PVY基因组5`非编码区序列，7～831 bp为p1基因序列，832～852 bp为HC-pro基因部分序列.通过上述方法已克隆获得PVY黑龙江省克山分离物、山西省临县分离物、贵州省贵阳分离物、威宁分离物的p1基因和cp基因(Genbank序列号分别为FJ766535， FJ766536， EU719650， EU675327，FJ766533，FJ423029，FJ423031，FJ423030).

图1 PVY cp基因PCR产物及质粒酶切鉴定Fig.1 The PCR produce of PVY cp gene and the identification of recombination plasmid by restriction enzyme cleavage

图2 PVY p1基因PCR产物及质粒酶切鉴定Fig.2 The PCR produce of PVY p1 gene and the identification of recombination plasmid by restriction enzyme cleavage

2.2 依据p1基因和cp基因序列鉴定中国PVY分离物株系类型

2.2.1 依据p1基因和cp基因建立PVY系统进化树 前期研究证明单独利用p1基因和cp基因序列分析均无法对PVY全部株系种类进行准确鉴定，但将两基因联合后分析可达到很好的鉴定效果［9］.因此，本研究将p1基因和cp基因联合后建立PVY系统进化树，对同时克隆获得p1基因和cp基因的中国PVY分离物进行分析，结果如图3所示.由图可知，在系统进化树中中国黑龙江省克山(KSH)分离为PVYNTN株系;贵州省贵阳(GY)分离物、威宁(WN)分离物、山西省临县(LX)分离物为PVYN:O株系.

图3 依据cp和p1基因建立PVY株系间系统进化树Fig.3 The phylogenetic tree of PVY strains based on the cp and p1 gene sequences

贵阳(GY)分离物、威宁(WN)分离物、临县(LX)分离物虽然明显具有PVYN:O株系的分子特征，但在系统进化树中它们与来自美洲的6个PVYN:O株系分离物仍然具有一定距离.上述情况说明来源中国的PVYN:O株系具有一定的地域分子特征，它们可能是在中国单演化而来，而不是从欧美地区传入中国的.

2.2.2 p1基因和cp基因中基因重组位点分析通过研究发现来自欧美的PVYO株系和PVYN株系间p1基因和cp基因存在明显的分子差异，具有各自不同的分子序列特征.PVYNW株系的p1基因存在1个重组位点，而cp基因无重组位点，全部表现为PVY°株系的cp基因特征.PVYN:O株系的p1基因和 cp基因均无重组位点，p1基因表现为PVYN株系特征，而cp基因则表现为PVYO株系特征.PVYNTN株系的cp基因均存在1个重组位点，而p1基因则存在1个或无重组位点.利用此规律对中国4个不同分离物的p1基因和cp基因进行分析，结果如图4所示，由图4可以证明KSH分离物为PVYNTN株系.GY分离物、WN分离物和LX分离物为PVYN:O株系，这与利用系统进化树的分析结果相同.

3 讨论

在前期研究中分别对河南省PVY进行了分子鉴定［9］，明确了PVY在河南省马铃薯田间的发生情况，并证明利用p1基因和cp基因序列联合分析可对PVY各株系进行分子鉴定.在此基础上，本研究进一步证明中国马铃薯主产区PVY已具有明显的株系分化现象，PVYNTN株系、PVYN:O株系均有发生，而且这些具有明显基因重组特征的株系可能已成为中国马铃薯田间PVY的流行株系，目前尚未见到相关的研究报道.

在本研究测定的4个不同地区的PVY分离物中，未发现 PVYN，PVYO，PVYC株系，其中3个地区的PVY分离物属于PVYN:O株系，这也说明目前在中国马铃薯田间PVY通过重组发生变异的现象十分普遍，PVYN:O株系的发生及分布范围十分广泛，可能已成为流行株系.通过分子序列分析，证明中国的PVYN:O株系具有明显的地域特征，说明这些株系可能是在中国单独演化而来的，也可能是从欧美等地传入中国后通过基因重组而产生，相关内容有待于深入研究.

近年来，有研究表明一些PVYNTN株系和PVYN:O株系分离物均可引起马铃薯块茎坏死病(Potato tuber necrotic ringspot disease，PTNRD)［1，10］，该病害的一个重要特征性症状是在马铃薯块茎的内部或外部引起环状、弧状坏死斑，严重影响马铃薯的品质和经济价值.本研究证明，PVYNTN株系和PVYN:O株系在中国均有发生，并且PVYN:O株系可能已成为中国马铃薯田间的主要流行株系，这表明在PVY防治工作中应加强对这些新的重组型株系的发生与危害情况的更为严格的监控，以便制定相应的防治策略，以确保马铃薯高产稳产.

［1］ BECZNER L，HORVATH J，ROMHANYI I，et al.Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato［J］.Potato Research，1984，27(3):339－352.

［2］ CHRZAOWSKA M.New isolates of the necrotic strain of potato virus Y(PVYN)found recently in Poland［J］.Potato Research，1991，34(2):179－182.

［3］ NIE X，SINGH RP.A new approach for the simultaneous differentiation of biological and geographical strains of potato virus Y by uniplex and multiplex RT－PCR［J］.J Virol Methods，2002，104(1):41 －54.

［4］ FANIGLIULO A，COMES S，PACELLA R，et al.Characterization of potato virus Y nnp strain inducing veinal necrosis in pepper:a naturally occurring recombinant strain of PVY［J］.Archive of Virology，2005，150(4):709－720.

［5］ 郭兴启.翻译与非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较［D］.杭州:浙江大学，2001.

［6］ 李 鹏.马铃薯Y病毒CP基因5'端和3'端反向重复结构介导的抗病性研究［D］.泰安:山东农业大学，2006.

［7］ 王秀芳，朱常香，温孚江，等.一个马铃薯Y病毒山东分离物的分离与鉴定［J］.植物病理学报，2003，33(3):203－208.

［8］ 石鹏君.马铃薯Y病毒HC-Pro和甘蔗花叶病毒CP基因的克隆、原核表达与抗血清制备［D］.泰安:山东农业大学，2004.

［9］ 陈士华，刘晓磊，张晓婷，等.河南省PVY高致病性株系的发现及其分子特征研究［J］.河南农业大学学报，2010，44(4):443 －447.

［10］ PICHE L M，SINGH R P，NIE X，et al.Diversity among PVY field isolates obtained from potatoes grown in the United States［J］.Phytopathology，2004，94:1368－1375.