响应曲面优化木瓜蛋白酶提高大豆分离蛋白乳化性的研究

张平安 ，赵秋艳，李 宁，宋莲军，乔明武，张建威

(河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

大豆分离蛋白(soybean protein isolate，SPI)是食品体系中广泛使用的一种蛋白质，其功能性质优异，添加到食品中可以改善产品性能，从而广泛应用于肉制品、乳制品、烘焙制品等［1］.其乳化特性影响到相关产品的生产和开发应用，但由于其本身乳化性能不高，达不到生产使用的要求，需通过各种物理、化学和生化手段对其进行改性和修饰，从而使大豆分离蛋白的功能性质得到显著改善，因此，通过改性提高大豆分离蛋白的乳化性具有十分重要的意义［2］.在影响大豆蛋白乳化能力的内在因素中，物化性质和结构是最重要的方面［3］.其中酶法改性被人们认为是一种较有潜力的改性方法.酶改性是利用蛋白酶的内切作用和外切作用将蛋白分子切割成较小的分子，使蛋白的功能特性有所提高.酶法改性具有条件温和，专一性强的特点.而木瓜蛋白酶主要存在于番木瓜中、稳定性好，对多种蛋白质均有较好的降解作用.另外其在中国南方资源丰富，其提取和生产工艺比较成熟，价格低廉［4，5］.因此，本研究选择木瓜蛋白酶针对提高大豆分离蛋白乳化性进行研究，并用响应曲面进行优化，旨在为大豆蛋白的深度开发利用提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

大豆分离蛋白(SPI)(哈尔滨高新科技大豆食品有限公司提供)，木瓜蛋白酶(Sigma公司50 000 U·g－1)，大豆油(市售).

1.2 仪器与设备

FA2004A分析天平(上海精天电子仪器有限公司);DK－90－ⅡA水浴锅(天津市素新特仪器有限公司);PHS－3C型pH计(上海安亭科学仪器公司);TDL－5－A离心机(上海安亭科学仪器公司);DJ1C型增力电动搅拌器(江苏大地自动化仪器厂);721型分光光度计(上海精密科学仪器公司).

1.3 试验方法

1.3.1 水解液的制备［6］大豆分离蛋白→加蒸馏水(配成一定的底物质量浓度)→恒温水浴中搅拌调至所需温度及pH(6.5)→加酶(E/S)→反应一段时间(期间维持T，pH恒定)→100℃水浴5 min 钝化酶→离心(5 000 r·min－1，20 min)→收集上清液.

1.3.2 乳化性及乳化稳定性的测定浊度法［7］将溶液倒入塑料搅拌杯中，按V(油)∶V(水)=1∶3添加90 mL溶液、30 mL油，在增力电动搅拌器最大转速下搅拌5 min后立即取出200 μL用0.1%的SDS稀释到10 mL，用0.1%的 SDS作为空白，在500 nm下测定此时(0 min)的吸光值即为乳化值(EA)记做A500，10 min时仍用同样的方法取出200 μL用0.1%的SDS稀释到10 mL，用0.1%的 SDS作为空白，在500 nm下测定此时(10 min)的吸光值记做A'500.

1.4 试验设计

采用 Design-Expert 7.1中的 Box-Behnken程序，以酶质量分数、反应时间和反应温度为主要考察因子(自变量)，分别以 X1，X2，X3表示，并以+1，0，－1分别代表自变量的高、中、低水平.按方程xi=(Xi－X0)/ΔX对自变量进行编码.式中:xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长，根据单因素试验选定酶质量分数、反应时间和反应温度范围.试验因素水平及编码见表1.

表1 试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of response surface analysis

响应面试验结果见表2，利用 Design-Expert 7.1软件对试验结果进行二次回归分析，计算大豆分离蛋白的乳化活性Y1和乳化稳定性Y2的回归方程并进行方差分析.乳化活性Y1和乳化稳定性Y2的标准回归方程为:

1.5 数据处理

采用Design-Expert 7.1进行试验设计和数据处理，所有试验数据均3次重复.

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶质量分数对大豆分离蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

由图1可知，随木瓜蛋白酶用量的增加，大豆分离蛋白的乳化能力及乳化稳定性先是逐渐提高再逐渐降低，但从总体上看，乳化稳定性的变化趋势不大.当酶质量分数为2%时，乳化活性和乳化稳定性均达到最大值，分别为0.688和19.371.这可能是因为随着蛋白酶用量的增加，蛋白酶与大豆蛋白质分子接触概率增加，肽链水解程度随之增大，线性分子数目增加，球形分子数目减少，提高了蛋白质分子的柔韧性，使蛋白质分子在油－水界面上的排列更加有序，乳化能力增强.形成的蛋白质分子薄膜具有良好的黏弹特性和抗应变能力，乳化稳定性提高［8］.但当酶用量达到一定程度后，酶解程度过高，蛋白质过高的水溶性破坏了其乳化稳定性所需的亲水亲油平衡性.

表2 响应面设计与试验结果Table 2 Response surface design and results

图1 酶质量分数对大豆分离蛋白乳化性影响Fig.1 The Enzyme concentration effects on emulsible of SPI

2.2 反应时间对大豆分离蛋白乳化性的影响

由图2可知，随着反应时间的进行乳化活性和乳化稳定性有变大趋势，在1.5 h时达到最大，乳化活性和乳化稳定性分别为0.791和22.739.当反应时间继续增大时，底物浓度减少，产物浓度增加，由于产物对酶的抑制作用，使酶活力下降，从而导致改性反应速度降低，乳化性随之降低.

图2 改性时间对大豆分离蛋白乳化性的影响Fig.2 The time effecting on emulsible of SPI

2.3 反应温度对大豆分离蛋白乳化性的影响

由图3可知，随反应温度的提高，大豆分离蛋白的乳化活性及乳化稳定性先是逐渐提高再逐渐降低，当改性温度45℃时大豆分离蛋白的乳化活性和乳化稳定性达到最大值，分别为0.587和16.281.这可能是因为酶有自身的最适温度，在这一温度时，酶解反应速度最大，可以使大豆分离蛋白最大限度水解从而使其侧链的亲水基朝向水相，疏水基朝向油相，使酶解后的蛋白质分子易于定位于油—水界面，使得水和油之间的界面张力减小，乳化性增大.而超过这一温度，酶就会变性，反应速度减小，乳化活性和乳化稳定性都会下降［9］.

图3 改性温度对大豆分离蛋白乳化性的影响Fig.3 The temperature effecting on emulsible of SPI

2.4 大豆分离蛋白乳化活性和乳化稳定性响应面分析

由表3和表4的方差分析结果可以看出，两模型 R2分别为0.867 5 和0.894 9，F 值分别为 3.20和3.14，P 值分别为0.042 0 和0.044 7，且失拟检验不显著，说明2模型高度显著，即方程Y1和Y2拟合3个因素与乳化活性和乳化稳定性之间的关系是可行的.从3因素对木瓜蛋白酶改性SPI的乳化活性的影响来看，Y1回归方程的一次项A对木瓜蛋白酶改性SPI的乳化活性均有显著影响，并且二次项A2，B2以及交互项中的AB也对乳化活性有显著的影响，其他因素影响不显著，这表明响应值的变化相当复杂，各个试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次关系，且3因素之间存在交互作用.而Y2回归方程的一次项B和C对SPI的乳化稳定性有显著的影响，二次项A2，B2也对其有影响.从回归方程的一次项系数可以看出3因素影响木瓜蛋白酶改性SPI的大小顺序为:反应时间＞酶浓度＞反应温度.

表3 乳化活性回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

表4 乳化稳定性回归方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for regression equation

为了考察交互项对提取率的影响，在其他因素条件固定不变的情况下，考察交互项对提取率的影响，对模型进行降维分析，经Design-Expert 7.1软件分析，所得的响应面见图4～5.从图4～5中可知，在因素所考察的范围内乳化活性和乳化稳定性均随着酶浓度、反应时间和反应温度的变化呈现先增大后降低的趋势，尤其是反应时间的影响最为明显，这与单因素试验和方差分析的结论相同.

2.5 大豆分离蛋白乳化性的响应面优化

本试验的目的是乳化活性和乳化稳定性越大越好，用 Design-Expert7.1软件进行试验优化，可信值为1.000的仅有1个试验方案，即酶质量分数1.74%，反应时间1.12 h，反应温度41.55 ℃，乳化活性和乳化稳定性分别为0.875和21.245.考虑到可操作性，将最优提取条件定为酶质量分数1.7%、反应时间1.1 h、反应温度42℃.用此最优提取条件进行验证，得到乳化活性和乳化稳定性分别为0.869和21.025，与理论值较为接近，表明数学模型对优化木瓜蛋白酶提高大豆分离乳化性可行.

3 结论

利用Design Expert 7.1软件设计试验，既可将复杂的试验次数简化，亦可得出较佳的试验结果，根据本研究数据模型分析可知，影响因子对酶改性大豆分离蛋白的乳化性的影响依次为反应时间＞酶浓度＞反应温度，通过优化试验确定木瓜蛋白酶提高大豆分离蛋白乳化性的最佳酶解条件为:酶质量分数1.7%，反应时间1.1 h，反应温度42℃，该条件下大豆分离蛋白的乳化活性和乳化稳定性分别为 0.869 和 21.025.

［1］石彦国.大豆制品工艺学［M］.北京:中国轻工业出版社，2005:52－59.

［2］张长付，王金水，高晓雷.木瓜蛋白酶水解提高绿豆分离蛋白乳化性研究［J］.郑州工程学院学报，2004，25(1):1－2.

［3］熊 华.木瓜蛋白酶应用研究进展［J］.保鲜与加工，2006，6(1):7 －8.

［4］刘 瑾.酶法改善大豆分离蛋白起泡性和乳化性的研究［D］.无锡:江南大学，2008.

［5］徐红华.不同酶类改性对大豆分离蛋白功能性质的影响［J］.食品科技，2007，32(3):35－38.

［6］孙冰玉，石彦国，朱会芳.木瓜蛋白酶提高醇法大豆浓缩蛋白乳化性的研究［J］.食品科学，2006，27(12):1－4.

［7］赵冬艳，董海洲.木瓜蛋白酶提高谷朊粉乳化性的研究［J］.粮食与饲料工业，2005(11):1－3.

［8］沈 宁，杨 光.酶改性提高花生蛋白乳化性的研究［J］.食品工业，2008，19(2):28 －30.

［9］李 磊，迟玉杰，王喜波.琥珀酰化提高大豆分离蛋白乳化性的研究［J］.中国粮油学报，2010，25(9):17－22.