慈溪市本地樱桃叶蛋白SDS-PAGE分析

陈晓强，黄士文，乔君伟，王国良，徐雪权，谢国权

（1. 浙江省慈溪市横河镇农业技术服务中心，浙江 慈溪 315318；2. 浙江万里学院生物与环境学院 浙江 慈溪 315100）

慈溪市本地樱桃叶蛋白SDS-PAGE分析

陈晓强1，黄士文1，乔君伟2，王国良2，徐雪权1，谢国权1

（1. 浙江省慈溪市横河镇农业技术服务中心，浙江 慈溪 315318；2. 浙江万里学院生物与环境学院 浙江 慈溪 315100）

采用SDS-PAGE电泳方法对12个樱桃品系的叶蛋白进行电泳分析，并进行聚类分析，结果表明，每个样品分别获得多条蛋白质条带，慈溪市不同樱桃品种的叶蛋白的分子量有明显差异；聚类结果显示，12份不同樱桃种类在0.50时聚为3类：子陵1号、黑珍珠、短柄2号、相公殿、子陵2号、短柄2号为一类，童岙2号、红花樱、五月樱、诸暨短柄、下杨家为一类，童岙1号单独为一类。

慈溪；樱桃；蛋白质；SDS-PAGE

慈溪市樱桃种质资源丰富，但樱桃遗传背景尚不了解，品种混乱。近年来随着樱桃需求的急剧增加，提高樱桃的质量及产量可进一步增加慈溪樱桃果农的收入，为此，我们对研究这些樱桃品种的遗传关系进行研究，以明确12种樱桃品种的分类，并根据最后结果，确定出优良的樱桃品系，从而加快优良品种的推广和产量的提高。同时，本实验有助于解决生产上存在的同物异名和同名异物的问题，为进一步开展樱桃育种研究及生产利用奠定基础，也将为珍贵樱桃资源的保护与利用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

本实验选用的材料为慈溪市12个本地樱桃品系的嫩叶，研磨备用。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要化学药品和试剂 Tris-Bis、N, N’-甲叉双丙烯酰胺、三（羟甲基）氨基甲烷、甘氨酸、TEMED、SDS、考马斯亮蓝G250、冰乙酸、甲醇等由国药集团化学试剂有限公司生产；SDS-PAGE低分子量标准蛋白由中国科学院上海生物化学研究所监制。

1.2.2 主要仪器和设备 电子天平BS210S、冷冻离心机、Fresco凝胶成像设备、Gel Doc EQ恒温水浴锅、THZ-82数显、稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ-4型等。

1.2.3 主要溶液试剂 30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液，pH8.9）、浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液，pH6.7）、电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液，pH8.3）、1%TEMED、10%过硫酸铵（AP）、样品溶解液、染色液、脱色液、Tris提取液。

2 实验方法

2.1 叶片的选取

所用12个樱桃品系的嫩叶于2009年采自慈溪市的生产果园和农家院落，分别是子陵2号、子陵1号、相公殿、黑珍珠、本地长柄、短柄2号、诸暨短柄、童岙1号、童岙2号、红花樱、五月樱、下杨家。

2.2 样品预处理

将从生产果园采摘回的不同品种的樱桃嫩叶分别取出一部分用蒸馏水清洗几次除去叶片表面的杂质，摊开在干净的报纸盒中并置于45℃恒温通风烘箱中烘数小时得到干燥的叶片。

2.3 蛋白质提取

将上述预处理所得的干燥樱桃叶片，用电动粉碎机粉碎后放入封口塑料袋中，置于干燥器内备用。参照谷瑞升等[3]的Tris-HCl法方法并加以修改提取蛋白质：用电子天平称取0.2 g不同品种的樱桃叶片置于写有标号或名称的pv小管中，然后加入2 m L Tris提取液混匀后放置于－20℃冷冻。待样品冷冻后取出样品加石英砂冰浴碾磨成糊状在4℃冰箱中静置提取1 h，然后在4℃冷冻离心机10 000 r/min离心10 min，根据丙酮沉淀法是非常有效的蛋白质沉淀方法[4]，能够消除瞬时的蛋白质水解作用和其他蛋白酶的修饰[5]，吸取上清液分别转移到与之相对应的pv小管中，在上清液中加入2 m L丙酮溶液混匀后置于4℃冰箱中沉淀过夜，待蛋白质沉淀后在4℃冷冻离心机10 000 r/min离心10 min，弃上清液，再向沉淀中加入2 m L Tris提取液让蛋白质充分溶解，然后重复上面的步骤提纯蛋白质，最后将蛋白质沉淀置于4℃冰箱中保存备用。丙酮沉淀的最大缺点是蛋白质很难重新溶解[6]。利用该方法从樱桃叶片提取蛋白质产量低。

2.4 实验步骤

2.4.1 样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，向处理好的待测蛋白质pv小管中加入200 μL的上样缓冲液，准蛋白于上样缓冲液各取15 μL按1：1的比例混合，沸水浴加热3 min，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1～3 min，以消除亚稳态聚合。一般加样体积为10～15 μL。如样品较稀，可增加加样体积。本实验加样体积为20 μL，用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。

2.4.2 电泳 实验采用稳压电泳，设定值为：进入分离胶前为稳压60 V，进入分离胶后为稳压120 V。当溴酚蓝指指示剂迁移至距下沿约1.5 cm处即停止电泳。拔掉固定板，取出玻璃板，用起胶板轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记取出凝胶。

2.4.3 染色及脱色 将电泳好的凝胶置于装有蒸馏水的洗胶盒中，每5 min换1次蒸馏水，清洗3次后，取出凝胶放入染色盒中，向染色盒中加入染色液，在35℃左右的恒温振荡水浴锅中染色约20 min后用重复用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，脱色完成后对胶板进行扫描。

3 结果与分析

3.1 实地调查分析

3.1.1 相公殿樱桃 位于30° 16′ 23.7″ N，121° 17′ 47.4″ E，海拔3 m，果实桃形，大小1.7 cm×1.7 cm×1.5 cm，果柄长1.72 cm，果核大小1.1 cm×0.7 cm×0.8 cm，可溶性固形物含量10%。

3.1.2 童岙1号 位于30° 05′ 05.7″ N，121° 12′ 46.2″ E，海拔31 m，果实大小1.5 cm×1.4 cm×1.6 cm，果核大小0.66 cm×1.05 cm×0.82 cm，果实长圆形，缝线明显，可溶性固形物10.5%。

3.1.3 童岙2号 生长势中庸，口感好。

3.1.4 子陵1号 位于30° 05′ 42.4″ N，121° 11′ 09.6″ E，海拔5 m，可溶性固形物14%，果实大小1.5 cm× 1.5 cm×1.3 cm，果核大小1.0 cm×0.8 cm×0.6 cm，口感好。丰产性好。

3.1.5 子陵2号 位于30° 05′ 30.8″ N，121° 11′ 28.0″ E，海拔13 m，果实大小1.7 cm×1.5 cm×1.4 cm，果核大小0.85 cm×0.75 cm×0.6 cm，可溶性固形物15%，橙红色，口感好，丰产性好。

3.1.6 红花樱桃 从嵊县引入，果实较小，花红色明显区别于其他品系，其他性状目前不明显。

3.1.7 五月樱 从嵊县引入，较本地早熟品系晚10天。其他目前不明显。

3.1.8 诸暨短柄 嵊县引入，果实大小1.5 cm×1.47 cm×1.30 cm，核大小0.81 cm×0.56 cm×0.65 cm，可溶性固形物12%。

3.1.9 本地长柄 果实大小1.6 cm×1.6 cm×1.37 cm，果核大小0.91 cm×0.56 cm×0.71 cm，可溶性固形物13%，口感好。

3.1.10 黑珍珠 从余姚引入，果实大小1.83 cm×1.74 cm×1.80 cm，果核大小0.9 cm×0.82 cm×0.71 cm，可溶性固形物14.5%，口感好。

3.1.11 短柄2号 从余姚引入，果实大小1.5 cm×1.5 cm×1.4 cm，果核0.9 cm×0.7 cm×0.5 cm，可溶性固形物14%，口感好。

3.1.12 下杨家 位于30° 05′ 50.7″ N，121° 11′ 32.4″ E，海拔6 m，果实大小1.72 cm×1.5 cm×1.5 cm，果核大小0.9 cm×0.75 cm×0.65 cm，可溶性固形物13%，口感好。

3.2 扫描图

使用GS-800 Calibrated Densitometer对凝胶进行扫描，得到扫描图片（图1，图2）。

图1 前6个樱桃品系蛋白质扫描图片Figure 1 Protein picture of 6C. pseudocerasusvarieties

图2 后6个樱桃品系蛋白质扫描图片Figure 2 Protein picture of the other 6C. pseudocerasusvarieties

将电泳得到的图谱使用GS-800 Calibrated Densitometer进行扫描，得到扫描图运用Quantity one软件进行分析。在Quantity one软件中，首先进行图像显示优化，如去噪点等。然后进行定量分析，得到定量分析图谱。在定量操作中可以去除背景参数等，然后创建泳道和条带进行电泳条带分析和带匹配操作。在电泳条带分析功能中，创建定量标准。此步操作是为了在报告中得到各条带的分子量。最后，在通过这些操作之后，在Reports和Analysis中等得各种分析报告和图表。

3.3 蛋白质带分析

运用Quantity one软件，对电泳图谱进行带匹配操作，在完成该操作后得到了电泳条带匹配图谱。

图3 前6个樱桃品系蛋白质电泳条带匹配图谱Figure 3 Protein bands of 6C. pseudocerasusvarieties

图4 后6个樱桃品系蛋白质电泳条带匹配图谱Figure 4 Protein bands of the other 6C. pseudocerasusvarieties

3.3.1 相对分子质量分析 运用Quantity one软件，输入已知的SDS-PAGE低分子量标准蛋白的6条相对分子量14.4、20.1、31、43、66.2、97.4 KDa对带匹配图谱中各样品的相对分子量进行计算。得出下图所示的相对分子质量图谱。

图5 前6个樱桃品系蛋白质相对分子质量图谱Figure 5 Relative molecular mass of protein of 6C. pseudocerasusvarieties

图6 后6个樱桃品系蛋白质相对分子质量图谱Figure 6 Relative molecular mass of protein of the other 6 C. pseudocerasus varieties

由于标准蛋白质的最大条带的分子量为97.4 KDa，所以把大于97.4 KDa的分子条带按相差50 KDa的蛋白质条带划归为同一个蛋白条带，把小于97.4 KDa大于10 KDa的分子条带按相差10 KDa的分子条带归为同一个条带，而小于10 KDa的蛋白质按相差3 KDa分子量的蛋白条带划归为同一蛋白质条带。根据自定的规则出样品蛋白条带的分布报告。

表1 不同樱桃品种样品条带相对分子质量分布报告Table 1 Relative molecular weight of protein bands from differentC. pseudocerasusvarieties

3.3.2 泳道中带分布 从表2中可以看到，12个樱桃样品共产生18条不同的条带。从这18种条带图普中可以把样品分为3类，其中子陵1号、黑珍珠、本地长柄、相公殿、子陵2号都有条带5、6、7、17、18，可以大致判断这5种品种的樱桃属于同一品种，亲缘性比较接近；而短柄2号有条带5、6、17、18，与子陵1号的亲缘性比较接近，但跟前5种的亲缘性相对比较远一点；童岙2号、红花樱、五月樱、诸暨短柄、下杨家都有条带条带6、10、16，可以大致判断出这五种樱桃属于同一品种，亲缘性比较接近；童岙1号只有条带2和16，与上面判断出来的两种品种相同，因此把童岙1号单独归为一种品种。

表2 条带分布报告Table 2 Distribution of protein bands

3.4 列相似性分析

Quantity one软件提供了多种方式来比较列相似性，列相似性图表和列相似性报表，都以最直观的方式反映列相似性。

3.4.1 相似性图表 从图7、图8、图9、图10中我们可以看到，电泳图谱中各列的条带在数量以及电泳迁移距离上的区别。

图7 前6个樱桃品系蛋白质列相似性图表Figure 7 Similarity of 6C. pseudocerasusvarieties

图8 后6个樱桃品系蛋白质列相似性图表Figure 8 Sim ilarity of the other 6C. pseudocerasusvarieties

图9 相异系数Figure 9 Correlation coefficient

表3 相异系数Table 3 Correlation coefficient

3.4.2 聚类分析 根据条带分布报告，反映的是各列（品种）之间的差异性。

从图9和表3可看出，12个樱桃样品可分为3个类型，其中本地长柄、子陵1号、黑珍珠、短柄2号、相公殿、子陵2号可以归为一类；童岙2号、红花樱、五月樱、诸暨短柄、下杨家可以归为一类；剩下的童岙1号单独为一类。但是各个品种之间又存在一定的差异，子陵1号和黑珍珠相差0.25，本地长柄和子陵1号相差0.285 7，短柄2号和子陵2号相差0.285 7，相公殿和子陵2号相差0.3，子陵2号和子陵1号相差0.333 3，童岙2号和红花樱相差0.375，诸暨短柄和五月樱相差0.375，下杨家和五月樱相差0.375，五月樱和童岙2号相差0.4444，童岙1号和童岙2号相差0.5，童岙1号和子陵1号相差0.545 5。

4 结论

对12个品系樱桃叶片进行蛋白质的提取实验，最后得到一个比较好的提取方法，即对样品进行20 m in左右的碾磨，4℃静置提取1 h，离心转速10 000 r/m in。但还存在有些批次加入染色液进行电泳时出现了絮状物（很可能是由于提取得到的蛋白质含量浓度过高）；在相同的处理条件下有些肉眼几乎都看不清楚有没有条带；同时在后面的若干次电泳中对样品进行了不同倍数的稀释处理，得到的条带不是很清楚，但拖尾现象还是比较明显等问题。

得到电泳图后使用Quantity One软件对其进行处理分析。通过带分析和列相似性分析，可看出不同品种间电泳条带的区别：子陵1号、黑珍珠、本地长柄、相公殿、子陵2号这5个品种中含有5条相同条带，不同条带比较少，而短柄2号与这些有4条相同的条带，故可以初步分为亲缘性比较近的同一樱桃品种；童岙2号、红花樱、五月樱、诸暨短柄、下杨家这5个品种有3条相同的条带，可以初步分为亲缘性比较近的同一樱桃品种；童岙1号与上述两个品种相同的条带比较少，不同条带比较多，差异性比较大，故单独归为一个樱桃品种。这个初步认定结果跟后期的聚类分析所得的结果相一致。

蛋白质条带分析可以快速的鉴定不同品种间的亲缘性关系，但是这种方法有一个比较显著的缺点，蛋白质的提取率低。蛋白质是一种极具多样性的生物大分子，离开其天然环境，蛋白质分子极不稳定，将很快失去生物学活性，因此确定提取条件是一个蛋白质提取中最基本的问题。另外就是蛋白质的提取液，提取时间和离心转速。根据摸索实验，我们终于找到一种比较好的实验方法：提取液选用0.4 mol的Tris-Hcl提取蛋白质，提取时间选用4℃提取1 h，离心转速10 000 r/m in，不过做出的胶片还不理想，有待进一步研究。

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SDS-polyacrylam ide Ge l Electrophoresis Ana lysis on Protein in Cerasus pseudocerasus Leaf in Cixi

CHEN Xiao-qiang1，HUANG Shi-wen1，QIAO Jun-wei2，WANG Guo-liang2，XU Xue-quan1，XIE Guo-quan1
（1. Henghe Agricultural Center of Cixi of Zhejiang, Cixi 315318, China;
2. Zhejiang Wanli University, College of Biological & Environmental Sciences, Cixi 315100, China）

SDS- polyacrylam ide gel electrophoresis analysis was conducted on protein in 12 varieties ofCerasus pseudocerasusleaf cultivated in Cixi, Zhejiang province. Cluster analysis demonstrated that each sample had several protein bands, but had different molecular weight. The result showed that 12 varieties could be divided into three categories.

Cixi;Cerasus pseudocerasu; protein; SDS_PAGE

S662.5

B

1001-3776（2011）01-0016-07

2010-09-25；

2010-11-05

慈溪市科技局农业社会发展类科技计划项目“中国樱桃新品种引进与配套栽培技术研究”（CN2008010），慈溪市农业局农业科技计划项目“中国樱桃新品种引进与配套栽培技术研究”（200816）

陈晓强（1959－），男，浙江慈溪人，工程师，从事要果技术研究和推广。