梯度洗脱高效液相色谱法检测注射用替加环素的有关物质

谢安云，徐洁昵，陈丽华

替加环素(Tigecycline，商品名:Tygacil)为甘氨酰环素类抗生素，其结构与四环素类药物相似，具有超广谱抗菌活性，对革兰阳性和革兰阴性需氧菌、非典型致病菌以及厌氧性细菌，特别是对耐药致病菌(如 MRSA、PRSP、VRE)和对糖肽类抗生素敏感性降低的葡萄球菌均具有很高的活性。此外，替加环素对产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌，以及包括大部分脆弱拟杆菌在内的多数肠杆菌属也具有活性［1-2］。根据替加环素的合成工艺，本品中可能存在的杂质主要有反应初始物米诺环素、中间体9-氨基米诺环素、9-硝基米诺环素以及反应副产物4-差向相异构体。通过结构分析，替加环素与9-氨基米诺环素、4-差向相异构体的极性相对接近，而与米诺环素、9-硝基米诺环素的极性差异较大，采用一般的等强度洗脱难以实现各中间体及主峰的同时分离，故本文选用梯度洗脱方式，对本品有关物质检查，并进行方法学研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪(515泵，2487检测器，7725i手动进样器);大连依利特EC2000色谱数据工作站及泵控系统;大连依利特ZW柱温箱;北京通用TU1810紫外-可见分光光度计;Mettler AE100电子分析天平;Gemini C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱。

1.2 试药 乙腈(色谱纯，Caledon Laboratories LTD)、磷酸氢二钾、亚硫酸氢钠、氢氧化钾、乙二胺四乙酸二钠(分析纯，湖南师大化学试剂厂);水(乐百氏纯水);注射用替加环素(批号:100401、100402、100403，由长沙市华美医药科技有限公司提供)、9-氨基米诺环素(HPLC纯度＞95%，由长沙市华美医药科技有限公司提供)、盐酸米诺环素(HPLC纯度＞98%，重庆莱美药业有限公司提供)、替加环素对照品(批号:090908，纯度:99.5%，由长沙市华美医药科技有限公司提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Waters C18(5 μm，416 mm×250 mm);流动相:以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾4.35 g、乙二胺四乙酸二钠0.93 g，加水950 mL溶解，并用磷酸调节pH值至6.4)-乙腈(95∶5)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾4.35 g、乙二胺四乙酸二钠0.93 g，加水500 mL溶解，并用磷酸调节pH值至6.4)-乙腈(5∶5)为流动相B;梯度洗脱条件:0～40 min，A:85%→57%;40～55 min，A:57%→0%;55 ～56 min，A:0%→85%;检测波长:248 nm;流速:1.0 mL/min;进样浓度:200 μg/mL;进样量:20 μL。

替加环素与中间体9-氨基米诺环素、米诺环素均在248 nm的波长处有强吸收，故选择248 nm为本品有关物质检查的检测波长。

2.2 溶剂的配制 尽管本品易溶于水，但其在水溶液中的稳定性较差。考虑本品的理化性质，并参照相关文献，制备含有还原剂的溶液作为稀释液。具体制备方法:取4.35 g磷酸氢二钾和0.5 g亚硫酸氢钠于1 000 mL量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度，用1 mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至8.0，作为稀释溶剂。

2.3 溶液的制备 供试品溶液的制备:取本品适量(约相当于替加环素25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。对照溶液的制备:精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。系统适用性溶液的制备:精密称取9-氨基米诺环素、盐酸米诺环素各约12.5 mg，分别置100 mL量瓶中，用溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密称取替加环素对照品约50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加上述溶剂50 mL使溶解，加三氟醋酸2滴，摇匀，置60～70℃的水浴中加热约5 min，放冷;精密加入9-氨基米诺环素、米诺环素储备液各1 mL，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 系统适用性试验 在选定的色谱条件下，取系统适用性溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，9-氨基米诺环素、替加环素差向异构体、替加环素、米诺环素的保留时间分别为14.4、16.0、21.3、34.7 min，各色谱峰之间的分离度均大于2.0。替加环素主峰理论板数70 710。色谱图见图1。

图1 混合溶液的HPLC色谱图

2.5 专属性试验 贮备液的配制:照“2.3”项下的方法制备供试品溶液，作为贮备液。

酸破坏试验:量取贮备液9 mL，置具塞比色管中，加1 mol/L HCl溶液1 mL，摇匀，置室温下放置8 h，用1 mol/L NaOH溶液中和，滤过，取续滤液作为酸破坏溶液。

碱破坏试验:量取贮备液9 mL，置塑料瓶中，加1 mol/L NaOH溶液1 mL，室温下放置20 h。用1 mol/L HCl溶液中和，滤过，取续滤液作为碱破坏溶液。

氧化破坏试验:量取贮备液9 mL，置塑料瓶中，加30%双氧水溶液1 mL，摇匀，放置10 min，滤过，取续滤液作为氧化破坏溶液。

高温破坏试验:量取贮备液9 mL，置具塞比色管中，置95℃水浴中加热1 h，放冷至室温，滤过，取续滤液作为高温破坏溶液。

测定:精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图。由试验结果可见，本品在酸、碱、氧化、高温环境中较不稳定，有较多的降解杂质产生。在该色谱条件下，各试验条件下破坏的降解产物均能与本品主峰获得基线分离，表明该色谱系统的专属性较好，能有效检测本品的降解杂质。色谱图见图2。

2.6 供试品溶液的稳定性考察 取供试品溶液，分别置室温条件及低温(0～4℃)条件下放置，于0、2、4、6、8 h 时，分别精密量取 20 μL 进样测定。结果表明，供试品溶液在室温下放置，RRT为0.5的杂质增加明显;低温条件放置8 h，各杂质均无明显变化。故实验过程中供试品溶液应临时新配，并避光、低温放置。

2.7 进样精密度试验 精密量取对照溶液20 μL进样测定，连续平行分析6次，记录色谱图，量取主峰面积，RSD为0.7%。

2.8 检测限 精密量取贮备液适量，用溶剂逐级稀释成一系列浓度的稀溶液，分别精密量取各溶液20 μL进样测定，记录色谱图。当进样浓度为0.18 μg/mL时，主峰的S/N≈3，即最低检测限为0.18 μg/mL × 20 μL=3.6 ng。

2.9 样品中的有关物质检查 各批样品均按“2.3”项下的方法制备供试品溶液与对照溶液。精密量取对照溶液20 μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的10%～20%。再精密量取供试液和对照液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，溶剂峰忽略不计，量取各单个杂质峰面积，与对照液主峰面积比较。9-氨基米诺环素的峰面积不得大于主峰面积的0.7倍(0.7%)，替加环素差向异构体的峰面积不得大于对照液主峰面积的3倍(3.0%)，米诺环素的峰面积不得大于对照液主峰面积的1/2(0.5%)，其他单个杂质，峰面积不得大于对照液主峰面积的1/5(0.2%)，除差向异构体外的其他杂质，峰面积之和不得大于对照液主峰面积的3倍(3.0%)。三批供试品的测定结果见表1。

图2 不同破坏试验下注射用替加环素的HPLC色谱图注:A.酸破坏试验，B.碱破坏试验，C.氧化破坏试验，D.高温破坏试验;1.替加环素

表1 三批供试品的测定结果(%)

3 讨论

3.1 本品为氨基碱性化合物，文献报道［3］，替加环素的初始反应物米诺环素与主要合成中间体9-硝基米诺环素、9-氨基米诺环素的HPLC检测方法均采用磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液，加入少量乙二胺四乙酸二钠或三乙胺，用磷酸调节pH值为6.0～6.4)-乙腈为流动相，通过调整缓冲盐溶液的pH值及缓冲盐溶液-乙腈的比例，能较好地控制以上化合物的纯度。一般情况下，流动相中缓冲盐溶液的最佳浓度范围为0.01～0.1 mol/L。磷酸盐缓冲液浓度增大，各峰保留时间延长，考虑达到分离要求的情况下，尽量选择低浓度缓冲盐溶液，选择0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液。由于本品为含氮碱性药物，极性较大，易被色谱柱上活性硅醇基强吸附，造成色谱峰拖尾。此外，硅胶中的微量金属可以导致硅羟基的酸性增强，进而导致主峰拖尾;替加环素也易于与硅胶中微量的金属离子螯合而不易洗脱，为了消除金属离子的影响，从而使方法具有更好的耐用性，在流动相中加入了少量的金属螯合剂-0.002mol/L的EDTA二钠。

3.2 实验中分别考察了 pH 7.0、pH 6.4和 pH 5.0的磷酸二氢钾溶液-乙腈为流动相。结果显示，随着流动相中缓冲液pH值的提高，替加环素峰的保留时间增加，主峰与相邻杂质峰的分离度增加。当缓冲液pH值为6.4时，主峰与各主要杂质均达到良好分离，且保留时间适中。分别调节流动相缓冲溶液的pH值为6.3、6.5、6.6，从而考察盐溶液pH值对分离的影响，结果表明，缓冲溶液的pH值对各组分的保留时间及相互分离影响较大，故实验过程中要严格控制缓冲溶液的pH值。

［1］ 王明华，王明贵.新型甘氨酰环素类抗生素-替加环素［J］.中国感染与化疗杂志，2006，6(5):350-355.

［2］ 周澎涛，刘蕾.新型静脉用甘氨酰环素类抗菌药替加环素［J］.中国新药杂志，2007，16(4):328-332.

［3］ Lalitha K，Sum PE，Sylvain D，et al.Tigecycline and methods of preparing 9-nitrominocycline［P］.WO，2006/130501.