Alu-LTR PCR方法检测HAART治疗系列各细胞亚群的整合型HIV-1 DNA

李 娟 焦艳梅 高艳青 寇卜心 张 彤 吴 昊

(首都医科大学附属北京佑安医院性病艾滋病临床诊疗中心，北京 100069)

获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是人体感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一种严重危害人类健康的致死性传染病。高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)通过抑制病毒复制，恢复人体免疫功能。显著地提高了艾滋病的治疗效果，明显延长了病人的生存时间，改善了病人的生活质量，减少了病死率，因而逐渐发展成艾滋病的常规治疗方法。人们最初希望在2～3年的HAART治疗后能够治愈HIV，但发现即使长时期用药以后停止用药，病人外周血仍可产生病毒，其主要原因在于病毒储藏库的存在［1-2］。Chun T W等［3］发现在静止的CD4+T淋巴细胞中HIV-1病毒以整合的形式存在，形成了病毒储藏库。从急性期一直到疾病的晚期，HIV病毒颗粒主要由活化的CD4细胞产生。病毒优先感染及歼灭HIV-1特异的CD4细胞。在急性期机体中大概存在一百万到一亿个感染的静止CD4细胞。目前国内外公认的是主要存在于长期存活的CD4细胞中。机体中病毒储藏库主要存在于长期存活的CD4细胞及滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells，FDC)这 2 类细胞中［4］。而对于是否存在于CD8及B细胞内仍存在着争议。

Alu-PCR是目前常用的检测整合型HIV-1 DNA的实验方法。Alu序列是人类特有的，在基因组广泛分布并高度保守的间隔重复序列，平均间隔4 000 bp［5-6］。根据Alu序列和HIV-1基因组中的相对保守序列分别设计引物，可得到整合型HIV-1基因［7-9］。本研究利用已经建立的 Alu-LTR PCR方法，对HAART治疗系列的CD4+T，CD8+T及B细胞进行检测，明确不同细胞亚群及HAART治疗的不同阶段是否存在整合的HIV-1 DNA，对HIV病毒储藏库形成机制以及临床选择治疗时机提供了理论和实践依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象

20例HIV-1阳性标本来自2009年3月至2010年8月期间在首都医科大学附属北京佑安医院感染科HIV随访患者，所有患者均经过确证试验为抗HIV-1阳性，选择10例性别和年龄相匹配的健康未暴露于HIV-1者为阴性对照，研究对象情况见表1。

表1 研究对象情况Tab.1 General data of the subjects

1.2 方法

1)主要仪器和试剂:PCR扩增仪(Mastercycler Thermal Cyclers，美国)，琼脂糖凝胶电泳仪(DYY-6C型，北京六一仪器厂)，数码凝胶图像处理系统 (Gel Media System Tanon-1600R，上海天能科技有限公司)，CD4+T细胞、CD8+T细胞及B细胞纯化试剂盒(德国Miltenyi公司)，DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)，标准相对分子质量DNA〔宝生物工程(大连)有限公司〕，PCR扩增试剂Taq酶(上海生物工程技术服务有限公司)。

2)纯化CD4+T细胞:首先用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，按照德国Miltenyi公司细胞分选试剂盒纯化CD4+T，CD8+T及B细胞;用抗体进行细胞外染色，用流式细胞仪检测其纯度。

3)模板DNA的制备:用德国Qiagen公司生产的DNA提取试剂盒提取模板DNA，具体操作方法参照试剂盒说明书。

4)引物设计:首轮PCR Alu-LTR 5'端引物来自于人类保守的Alu序列，Alu-LTR 3'端引物来自于保守的HIV-1 LTR序列，为了增加检测的特异性，在针对HIV-1LTR的引物前加了一段lamda T载体的一段，类似是一段通用引物，在人体及HIV里面都没有。第2轮引物针对lamda T载体和U5区。首轮PCR产物稀释后，利用针对HIV-1 LTR特异的引物进行第2轮套式PCR，首轮PCR扩增片段包括了HIV-1整合位点上游的人类基因组DNA和整合的HIV-1 LTR的序列，第2轮扩增R，U5区(图1)。

图1 Alu-LTR PCR方法检测整合型HIV-1 DNA原理Fig.1 Principles of determination of integrated HIV-1 DNA with Alu-LTR PCR approach

5)PCR扩增:①PCR反应体系(50 μL):模板DNA 5.0 μL，dNTPs(Mg2+)4.0 μL，10 × PCR Buffer 5.0 μL，上游引物各 1.0、0.5、0.5 μL，下游引物各 1.0 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.4 μL，灭菌双蒸水33.6 μL。以灭菌双蒸水为空白对照，HIV-1阴性的健康人为阴性对照。②PCR反应适宜条件的选择:第1轮的扩增条件:首先是94℃ 3 min;然后94℃ 30 s变性，66℃ 30 s退火，70℃ 5 min延伸，共22个循环;最后72℃ 10 min。第2轮的扩增条件:首先94℃ 12 min;然后是95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共29个循环;最后72℃ 10 min。③PCR产物的鉴定:每种PCR扩增产物各取5μL与1μL的1 0×上样缓冲液混合，以及5 μL标准相对分子质量DNA，分别加到含EB的1.0%琼脂糖凝胶中。在90～110 V电压下电泳25 min，巢式反应产物在琼脂糖凝胶上形成可见的条带。④PCR产物割胶纯化、序列测定及序列比对:在凝胶成像系统下，将电泳后所在条带的凝胶切下，用试剂盒纯化并回收PCR产物，具体操作方法参照试剂盒说明书。委托北京六合通经贸有限公司测序。

2 结果

纯化后的CD4+T，CD8+T，B细胞用抗体进行细胞外染色，经流式细胞仪分析后纯化CD4+T，CD8+T，B细胞纯度分别是97.94%、98.00%、92.45%，详见图2。

图2 纯化CD4+T，CD8+T，B细胞结果Fig.2 Results of CD4+T，CD8+T，B Cells purification

经Alu-LTR PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后，结果显示20例患者HAART治疗系列0、4、12 W的CD4+T细胞和CD8+T细胞均可扩增得到1条约240 bp的条带，B细胞及阴性对照无扩增产物出现(图3～5)。

图3 CD4+T细胞Alu-LTR PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Amplified products of HIV-1 by Alu-LTR PCR from CD4+T cell and agarose electrophoresis

图4 CD8+T细胞Alu-LTR PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4 Amplified products of HIV-1 by Alu-LTR PCR from CD8+T cell and agarose electrophoresis

图5 B细胞Alu-LTR PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果Fig.5 Amplified products of HIV-1 by Alu-LTR PCR from B cell and agarose electrophoresis

3 讨论

HAART是当前治疗HIV慢性感染和AIDS最主要的临床手段，可明显改善HIV/AIDS患者的疾病进展和预后。虽然HAART可以使患者血浆中病毒降低到常规方法检测不到的浓度，但患者体内仍然存在低水平的病毒复制，此场所被称之为HIV储藏库。这种储藏库在急性期感染后几天内产生［10］，另外在病毒活跃复制的过程中，储藏库不断地产生。清除储藏库需要60年的时间［11］。储藏库的持久性使得人们要检测其建立、保持和解决储藏库。

对于HIV储藏库的细胞场所，1997年Chun T W等［3］在HIV感染病人中证实，发现在静止的CD4+T淋巴细胞中HIV-1病毒以整合的形式存在。目前研究［12］已经证实HIV能感染CD8+T细胞，尤其感染晚期。这可能与CD8+T细胞激活CD4表达增加有关。

本研究首先通过Alu-LTR PCR方法检测各细胞亚群是否存在整合型HIV-1 DNA，结果示外周CD4+T和CD8+T细胞内均可检测到整合型 HIV-1 DNA，CD8+T细胞所得目的条带明显弱于CD4+T细胞，说明HIV储藏库主要存在于CD4+T细胞内。从急性期一直到疾病的晚期，HIV病毒颗粒主要由活化的CD4细胞产生。病毒优先感染及歼灭HIV-1特异的CD4细胞。然而B细胞内未得到阳性结果，因此不能说明B细胞内存在整合型HIV-1DNA，进而不能说明B细胞是病毒储藏库存在的细胞。其次本研究对HAART治疗系列0、4、12周各随访点标本进行扩增，所得目的条带之间没有明显差异，说明随着HAART治疗的进程，整合型HIV-1 DNA仍然存在。

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