润肺丸的质量标准研究

王增仙， 高萧枫， 武敏霞， 李 平 (山西生物应用职业技术学院生物制药工程系， 太原 030031)

润肺丸是由连翘、麻黄、甘草、金银花、当归等药材组成，具有润肺解毒，祛痰止咳功效，是治疗阴虚肺燥型肺结核的常用处方。甘草、金银花有清热解毒、止咳祛痰的功效，连翘有消肿散结功效，麻黄能发汗散寒、宣肺平喘。药理实验表明连翘除了有广谱的抗菌作用外，还有显著的解热、抗炎、利尿、保护肝脏及镇吐作用，现代研究表明其主要有效成分为连翘苷(C29H34O15)。原标准仅收录了当归的薄层色谱鉴别，标准极不完善。本文旨在通过增加专属性强的薄层色谱鉴别及部分药味的含量测定项，从而提高完善润肺丸的质量标准。

1 仪器和试药

依利特P200Ⅱ高效液相色谱仪。当归对照药材(120927－200613)，连翘对照药材(120908－200411)，甘草次酸对照品(鉴别用，110723－200411)，盐酸麻黄碱对照品(鉴别用，171242－200405)，绿原酸对照品(鉴别用，110753－200413)，连翘苷对照品(含量测定用，110821－200711)均购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他所用试剂均为分析纯。润肺丸样品(批号:20091101，20091102，20091103):实验室自制。

2 薄层鉴别

2.1 当归 取本品25 g，剪碎，加二氯甲烷120 ml，超声处理10 min，滤过，滤液浓缩至约1 ml，作为供试品溶液。另分别取当归对照药材和当归药材各1 g，同法制成对照药材溶液和药材溶液。取除当归外的药味，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法［1］(中国药典2010年版一部 ⅥB)试验，吸取上述供试品、对照药材、药材和阴性对照溶液4种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷－甲苯－乙酸乙酯(2∶1∶1)混合溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(见图1)。

图1 当归薄层色谱图Fig 1 Thin layer chromatogram of angelica

2.2 连翘 取本品35 g，剪碎，加甲醇60 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。另分别取连翘对照药材及连翘药材各1 g，同法制成对照药材溶液和药材溶液。取除连翘外的药味，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部ⅥB)试验，吸取上述供试品、对照药材、药材、阴性对照溶液4种溶液各10 μl，分别点于同一以0.1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(40∶5∶10∶0.2)混合溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(见图2)。

图2 连翘薄层色谱图Fig 2 Thin layer chromatogram of forsythia

2.3 甘草 取本品9 g，剪碎，加三氯甲烷60 ml，盐酸6 ml，加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草药材1 g，同法制成药材溶液。另取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成2 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。取除甘草外的药味，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部ⅥB)试验，吸取上述供试品、药材溶液、阴性对照溶液各 10 μl、对照品溶液 5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(30－60℃)－甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸(20∶40∶14∶1)混合溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(见图3)。

图3 甘草薄层色谱图Fig 3 Thin layer chromatogram of licorice

2.4 麻黄 取本品9 g，研细，置50 ml锥形瓶中，加浓氨试液1 ml，乙醚30 ml，密塞，超声处理30 min，滤过，加酸性乙醇(取乙醇20 ml，加盐酸1 ml，混匀)1 ml，蒸干，残渣加甲醇0.5 ml使溶解，作为供试品溶液。另取麻黄药材1 g，同法制成药材溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成5 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。取除麻黄外的药味，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部 Ⅵ B)试验，吸取上述供试品、药材、阴性对照溶液各10 μl、对照品溶液2 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－浓氨试液(40∶10∶1)混合溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(见图4)。

图4 麻黄薄层色谱图Fig 4 Thin layer chromatogram of ephedra

2.5 金银花和山楂 取本品30 g，研细，加甲醇40 ml，摇匀，放置12 h，滤过，滤液作为供试品溶液。另分别取金银花、山楂药材各1 g，同法分别制成金银花和山楂药材溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。取除金银花和山楂外的药味，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部ⅥB)试验，吸取上述供试品、药材溶液、阴性对照溶液、对照品溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯－甲酸－水(10∶2∶3)的上层溶液混合溶液作为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(见图5)。

图5 金银花和山楂薄层色谱图Fig 5 Thin layer chromatogram of honeysuckle and hawthorn

3 含量测定

3.1 色谱条件［2－5］色谱柱:Kromasil ODS C18(5 μm，150 mm ×4.6 mm)。检测波长［1］:277 nm;流动相:乙腈 － 水21∶79，流速:1.0 ml/min。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液的制备 精密称取连翘苷对照品适量，加50%甲醇制成0.20 mg/ml的溶液，即得。

3.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，剪碎，取约9 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5 g拌匀，加置即得中性氧化铝柱(100－120目，1 g，内径1 －1.5 cm)上用70%乙醇80 ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解，转移至5 ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 阴性对照溶液的制备 取处方除连翘的全部药味，按成品工艺及供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

3.3 系统适用性实验 在上述色谱条件下，取供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，理论塔板数不低于3 000，主峰与其他杂质峰分离度大于1.5，符合要求。

3.4 专属性实验 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件检测，在连翘苷保留时间处，阴性对照无其他成分干扰，结果表明，测定方法专属性强，无干扰，结果见图6。

图6 连翘苷HPLC图Fig 6 High performance liquid chromatogram of phillyrin

3.5 线性关系考察 精密称取连翘苷对照品适量，加50%甲醇制成0.209 8 mg/ml的溶液，分别精密量取 1，2，3，3.5，4 ml至 10 ml量瓶中，用 50% 甲醇稀释至刻度，分别进样20 μl，测定。以连翘苷进样量(μg)对峰面积绘制标准曲线并进行线性回归，得回归方程为 y=107.38+184.66x，r=0.999 9(n=5)。结果表明，连翘苷在0.419 6 －1.678 4 μg范围内进样量与峰面积之间呈良好线性关系。

3.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，重复进样，连续测定5次，记录峰面积，RSD值2.58%，表明精密度良好，符合含量测定要求。

3.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号:20091101)，分别在制备后 0，2，6，12，24 h 后依法测定连翘苷的峰面积，结果连翘苷峰面积 RSD为0.98%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

3.8 回收率试验 采用加样回收方法，精密称取已知含量的样品(批号:20091101，0.355 1 mg/g)适量，分别加入一定量的连翘苷对照品，据3.2.2项下方法制备供试品溶液，依法测定，结果表明:该法具有良好的回收率，见表1。

表1 回收率测定结果Tab 1 Results of recovery test

3.9 重复性试验 取同批样品(批号:20091101)，依法平行制备6份，分别测定连翘苷的含量，RSD值为1.04%，结果表明供试品制备方法重复性良好，符合含量测定要求。

3.10 样品测定 精密吸取供试品溶液20 μl，按上述含量测定方法，分别对3批样品进行测定，结果见表2。

表2 3批样品中连翘苷的含量 (n=3)Tab 2 Content of phillyrin in samples (n=3)

参照3批样品的含量测定结果，求得平均含量为3.210 3 mg/丸。以平均含量的80%作为样品含量测定的限度，即本品含连翘以连翘苷(C29H36O15)计，每丸不得少于2.6 mg。

4 讨论

4.1 本品中当归、连翘、麻黄、甘草、金银花、山楂等均为主要药味，方法学研究结果表明，采用薄层色谱法对当归、连翘、麻黄、甘草、金银花、山楂等进行定性鉴别，薄层色谱斑点清晰、专属性强。其中金银花和山楂两味药存在干扰，选择了双阴性操作，在控制绿原酸的基础上，结合药材斑点，共同监控本品质量，在增加薄层鉴定药味数量同时，一定程度加强质量控制的效力。在进行TLC鉴别研究时，增加了相应药材的供试品溶液，以求保证本品质量的同时，监控投料药材的质量，可作为一种中成药TLC鉴别的一种思路，从源头控制产品质量。

4.2 连翘苷为连翘的主要有效成分，参考有关文献［3－5］，经研究对比，建立了连翘苷的含量测定法，经方法学验证，本法重现性好、阴性对照无干扰，操作简单，便于满足工业化生产的需要，可有效控制本品的质量，为保证用药的有效性提供技术支持。

4.3 色谱条件的选择依据 本文先后考察了甲醇－水、乙腈－甲醇 －水、乙腈 －0.05%磷酸(19.5∶80.5)，最后采用乙腈－水(21∶79)作为流动相测定连翘苷的含量，检测波长为277 nm，流速为1 ml/min。理论塔板数不低于3 000，主峰与其他杂质峰分离度大于 1.5，符合要求。

4.4 本文对未列入标准的其他药味做了薄层鉴别方法学考察，鉴于本品由十八味药材组成，干扰相对严重，按照传统方法试图鉴别其中的每一药味比较困难，干扰多，工作量大，且不能充分利用每一种色谱条件下表现出的丰富信息。为此，下一步将尝试采用“分组鉴别法”［6］，即按处方药味所含成分的类别进行分组，合并同类项，针对大类成分的特点进行鉴别，以达到充分利用色谱信息，提高鉴别效率，体现复方整体特征的目的。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］ 崔岩岩，冯少勇，赵光，等.连翘有效成分的HPLC法测定［J］.药学学报，1992，21(1):120 －123.

［3］ 陆红柳，潭喜莹，张飞，等.HPLC法测定连翘苷的含量［J］.中草药，1998，19(6):84 －85.

［4］ 何绍萍，陈华龙.高效液相色谱法测定小儿清解冲剂中连翘苷含量［J］.中国药业，2011，20(3):21 －22.

［5］ 钱淑琴，陈宗良.HPLC法测定宁泌泰胶囊中连翘苷的含量［J］.中华中医药学刊，2011，29(3):208 －209.

［6］ 周跃华.中药新药质量标准研究中常见问题浅析［J］.中成药，2004，26(11):972 －975.