缬沙坦对2型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响

孙尧，李文博，程燕，宋博毅

糖尿病心肌病变是糖尿病患者主要的并发症之一，也是导致其死亡的主重要原因，流行病学研究发现，糖尿病患者心肌病变较非糖尿病患者高2～3倍［1］。心肌细胞凋亡在糖尿病心肌损害的发生、发展过程中起着重要作用［2］，糖尿病时，心肌细胞能量代谢紊乱，功能改变，凋亡增加，心肌细胞凋亡与高血压、心力衰竭的发生发展密切相关［3］，所以减少心肌细胞凋亡，保护心肌细胞数量，改善糖尿病患者的预后成为众多学者研究的热点。近年来有研究显示缬沙坦除了能够有效降血压外，对糖尿病患者心肌也起到保护作用，但是其在抑制糖尿病心肌细胞凋亡方面的研究甚少。本实验以链脲佐菌素(streptozocin，STZ)建立糖尿病大鼠模型，观察Caspase-3和NF-κB在糖尿病大鼠心肌细胞中的表达，探讨缬沙坦通过抑制糖尿病大鼠心肌细胞的凋亡对糖尿病大鼠心肌的保护作用和可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组 实验动物为雄性SD大鼠29只(由河北联合大学动物实验中心提供)，体重(200±20)g。所有大鼠适应性喂养1周后，随机选取8只作为对照组(CN组)，以普通饲料喂养，自由进食水，余21只大鼠作为实验组，以高糖高脂饮食(10%猪油、20%蔗糖、2%胆固醇、1%胆酸钠、67%常规饲料)喂养，4周后腹腔注射链脲佐菌素(STZ，30 mg/kg;1 g STZ溶于100 ml柠檬酸盐缓冲液配制而成，pH 4.5)，CN组大鼠注射同等体积的柠檬酸盐缓冲液，每隔4 d注射1次，共注射3次，于最后一次注射STZ 72 h后禁食12 h，取大鼠尾静脉血测定血糖浓度，将血糖测定结果大于16.7 mmol/L视为2型糖尿病造模成功［4］。其中有19只大鼠造模成功，将其随机分为糖尿病组(DM组，9只)和缬沙坦组(VAL组，10只)。VAL组大鼠给予缬沙坦(20 mg/kg·d)灌胃6周，而CN组和DM组大鼠每日给予同量蒸馏水灌胃。共有25只大鼠完成实验，其中CN组8只，DM组7只，VAL组10只，2只大鼠死于糖尿病并发症。

1.2 主要试剂 Caspase-3多克隆抗体、NF-κB多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);PV6001试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);DAB底物显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);胰岛素放射免疫分析药盒(北京北方生物技术研究所，批号:1606-0606);TUNEL试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);缬沙坦(北京诺华公司)。

1.3 组织标本获取 大鼠禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(3 mg/kg)麻醉，打开腹腔取腹腔动脉血以检测血糖、血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、胰岛素抵抗指数以及胰岛素水平。而后打开胸腔，迅速取出心脏，以冰盐水冲洗，切取垂直于心脏左室长轴对称中点上下左室截面，厚度为2～3 mm，放入10%中性甲醛内，24 h后石蜡包埋。

1.4 血液指标检测 收集的血液标本，采用唐博士血糖仪及唐博士血糖试纸检测大鼠血糖，并记录血糖值;采用放射免疫法检测胰岛素水平，用公式胰岛素抵抗指数=空腹血糖×空腹胰岛素/22.5计算胰岛素抵抗指数;采用酶比色法检测TC、TG，测量结果均按照说明计算。

1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 ①标本处理:将左室前壁心肌组织常规石蜡切片，置于二甲苯中脱蜡30 min，梯度乙醇水化，PBS洗涤2次，蛋白酶K室温孵育，PBS洗涤2次，加入50 μl转化剂POD，在湿盒中37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入50～100 μl DAB底物溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，苏木素复染细胞核，封片。②结果观察:在Olympus显微镜下观察，测微网格置于目镜内，将病变区置于高倍镜(×400)下随机选择10个独立视野，每个视野下选100个细胞，统计出凋亡细胞数。以胞核中见到棕黄色和棕褐色颗粒为阳性细胞。

1.6 免疫组化染色 将左室前壁心肌组织常规石蜡切片，滴加第一抗体，4℃过夜，0.1M PBS洗5 min×3次;滴加生物素化第二抗体(IgG)，37℃ 20 min，0.1M PBS洗5 min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃ 20 min，0.1M PBS 洗5 min×3次;使用DAB显色试剂盒1ml蒸馏水加显色剂A、B、C各一滴，混匀，加至标本上，显色6 min，充分水洗;苏木素复染细胞核1 min，充分水洗、1%盐酸酒精分化、1%胺水反蓝、充分水洗、经70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇5 min两次、95%乙醇5 min两次、100%乙醇5 min两次脱水、二甲苯透明5 min两次、中性树脂封片。高倍镜(×400)下每张切片选取5个视野，分析Caspase-3的表达情况，取平均值。以看到棕黄色或棕褐色为阳性表达。

1.7 统计学处理 所有数据应用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，三组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况和生化指标观察 正常对照组和高脂高糖组喂养的大鼠精神活跃，动作灵活，毛色有光泽，生长速度较快，高脂高糖组大鼠体重增加速度明显快于正常对照组，27只大鼠无死亡。注射链脲佐菌素后大鼠出现明显多饮、多食、体重减轻的症状，血糖水平升高(P＜0.05)、胰岛素水平降低(P＜0.05)，总胆固醇、甘油三酯水平增高(P ＜0.05)，缬沙坦治疗组与糖尿病组比较，多饮多食、体重减轻情况减轻，血糖、胰岛素水平、总胆固醇、甘油三酯水平无明显变化(P＞0.05)(表1)。

2.2 TUNEL及免疫组化检测 心肌细胞凋亡检测可见，CN组TUNEL阳性细胞很少，与CN组相比DM组和VAL组TUNEL阳性细胞明显增多;两两比较结果，DM组与CN组、VAL组与CN组之间均有差异(P均 ＜0.05)，而 VAL组和 DM组比较 TUNEL阳性细胞减少，差异具有显著性(P＜0.05)。免疫组织化学染色分析可见:Caspase-3和NF-κB在DM组和VAL组中均高表达;DM组阳性表达率明显高于CN组及VAL组，差异具统计学意义(P均 ＜0.05)(表1)。

3 讨论

糖尿病是影响心功能的一个独立危险因素，近年来在糖尿病心肌损害的研究中发现细胞凋亡参与糖尿病心肌病变，心肌细胞数量的降低可能是导致糖尿病心功能障碍的重要原因之一［5］。因此如何防止心肌细胞凋亡的发生和发展，减少心肌细胞的丢失，改善糖尿病患者的预后成为众多学者关注的热点。本实验以STZ建立糖尿病大鼠模型，TUNEL法观测糖尿病大鼠左室心肌细胞凋亡情况，免疫组化法检测Caspase-3和NF-κB在心肌中的表达，从而探讨缬沙坦对糖尿病大鼠心肌细胞的保护作用及可能机制。

Caspase是一切凋亡信号传导的共同通路，Caspase如同凝血因子一样“瀑布式”(cascade)层层激活，最终引发细胞凋亡［6］。Caspases-3在Caspase级联反应中处于核心位置，可被其上游信号激活，从而导致细胞凋亡。有研究显示，Caspases-3是Fas介导细胞凋亡蛋白级联反应中的下游“核心”蛋白酶，AT1受体拮抗剂通过阻断血管紧张素Ⅱ的作用抑制Fas的活性［9］，从而使Caspases-3介导的细胞凋亡受到抑制［7-8］。本实验研究发现与CN组相比，DM组Caspases-3阳性表达明显增高，凋亡细胞显著增加，应用缬沙坦以后VAL组Caspases-3阳性表达明显降低，凋亡细胞减少，表明Caspases-3可能参与糖尿病大鼠心肌细胞凋亡，缬沙坦可以抑制糖尿病大鼠的心肌细胞凋亡，其机制可能通过抑制血管紧张素Ⅱ的作用降低Fas的活性从而减少Caspases-3的表达，抑制心肌细胞的凋亡，保护心肌细胞。

表1 三组大鼠生化指标、心肌细胞TUNEL和免疫组化染色检测(±s)

表1 三组大鼠生化指标、心肌细胞TUNEL和免疫组化染色检测(±s)

注:与 CN 相比，aP＜0.05;与DM 组相比，bP ＜0.05

项目 CN组(n=8) DM组(n=7) VAL组(n=10)血糖(mmol/L) 5.09 ±0.15 21.61 ±1.9a 20.15 ±1.08a胰岛素(μIU/ml) 28.46 ±1.06 22.17 ±1.41a 19.97 ±0.80a胰岛素抵抗指数 6.54 ±0.31 21.33 ±2.77a 19.53 ±1.19a总胆固醇(mmol/L) 1.83 ±0.10 5.06 ±0.12a 4.71 ±0.24a甘油三酯(mmol/L) 1.76 ±0.11 5.0 ±0.11a 4.70 ±0.21a TUNEL 3.72 ±0.52 34.52 ±1.33a 16.53 ±1.19ab Caspase-3 5.23 ±0.36 20.22 ±0.30a 15.25 ±0.45ab NF-κB 6.06 ±0.40 27.63 ±0.48a 18.06 ±0.71ab

NF-κB在糖尿病的发生发展中起着关键作用，调控着一系列与凋亡有关的基因，在正常心肌中NF-κB 和 NF-κB 抑制蛋白(IκB)相结合，以失活状态存在于胞质中，当糖尿病时体内血糖升高可激活信号转导通路，导致NF-κB和IκB磷酸化解离，NF-κB与靶基因增强子的κB位点特异性结合启动靶基因的转录，有研究证实［10］，NF-κB 引起心肌细胞凋亡的靶基因包括Fas、Fas配体及p53等促凋亡基因。本实验中DM组与CN组相比NF-κB阳性表达显著增加，凋亡细胞增多，VAL组NF-κB阳性表达较DM组明显降低，凋亡细胞减少，表明NF-κB与糖尿病大鼠心肌细胞凋亡有关，缬沙坦能够抑制NF-κB的促凋亡作用，其机制可能是通过降低Fas、Fas的配体及p53的活性，从而抑制心肌细胞凋亡。

本实验显示糖尿病大鼠心肌细胞中存在着细胞凋亡，缬沙坦能明显抑制糖尿病大鼠心肌细胞凋亡，下调Caspase-3和NF-κB的表达，但没有影响血糖、血脂及胰岛素抵抗情况，推测缬沙坦可能通过阻断血管紧张素Ⅱ的作用，降低Fas的活性，调节凋亡相关因子Caspase-3和NF-κB表达抑制心肌细胞凋亡，发挥对心肌的保护作用，但是由于实验组大鼠血糖血脂都未得到控制，血糖与血脂是否与心肌细胞凋亡有关有待于进一步研究。

［1］ Thrainsdottir IS，Aspelund T，Thorgeirsson G，et al.The association between glucose abnormalities and heart failure in the populationbased Reykjavik study［J］.Diabetes Care，2005，28(3):612-616.

［2］ Okoshi K，Guimaraes JF，Di Muzio BP，et al.Diabetic cardiomyopathy［J］.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007，51(2):160-167.

［3］ Conrad CH，Brooks WW，Hayes JA，et al.Myocardial fibrosis and stiffness-with hypertrophy and heart failure in the spontaneously hypertensive rat［J］.Circulation，1995，91(1):161-170.

［4］司小晨，尚文斌，卞慧敏，等.链脲佐菌素加高脂膳食诱导2型糖尿病大鼠模型［J］.安徽中医临床杂志，2003，15(5):383-385.

［5］ Yue TL，Bao W，Gu JL，et al.Rosiglitazone treatment in Zucker diabetic Fatty rats is associated with ameliorated cardiac insulin resistance and protection from ischemia/reperfusion-induced myocardial injury［J］.Diabetes，2005，54(2):554-562.

［6］ Martin DA，Siegel RM，Zheng L，et al.Membrane oligomerizationand cleavage activates the caspase-8(FLICE/MACHα1)deathsignal［J］.J Biol Chem，1998，273(8):4345-4349.

［7］ Perera L，Waldmann TA.Activation of human monocytes induces differential resistance to apoptosis with rapid down regulation of caspase-8/FLICE［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(24):14308-14313.

［8］ Condorelli G，Roncarati R，Ross J，et al.Hearttargeted overexpression of caspase-3 in mice increases infarct size and depresses cardiac function［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(17):9977-9982.

［9］ Carlsson PO，Palm F，Andersson A，et al.Chronically decreased oxygen tension in rat pancreatic islets transplanted under the kidney capsule［J］.Transplantation，2000，69(5):761-766.

［10］ Kimura K，Asami K，Yamamoto M.Structure of the promoter for the rat Fas antigen gene［J］.Bochim Biophys Acta，1997，1352(3):238-242.