eNOS基因多态性与汉族人糖尿病合并颈动脉粥样硬化关系

卢瑞春王昊郁金泰谭兰

·论 著·

eNOS基因多态性与汉族人糖尿病合并颈动脉粥样硬化关系

卢瑞春*王昊△郁金泰*谭兰*

目的 探讨内皮型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，eNOS）基因第4内因子基因27 bp数目可变的串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多态性与糖尿病合并颈动脉粥样硬化的关系。方法 纳入189例糖尿病合并颈动脉粥样硬者和240名对照，分析各组间的等位基因频率与基因型频率的差异。结果 糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者的 a等位基因频率高于对照组 （9.78%、6.04%，χ2＝4.119，P＜0.05），差别有统计学意义；4a／4b＋4a／4a基因型频率在糖尿病合并颈动脉粥样硬化组高于对照组 （17.38%、11.65%，χ2＝5.518，P＜0.05），差异有统计学意义。用Logistic回归分析发现4a等位基因与糖尿病合并颈动脉粥样硬化具有显著相关性（OR＝1.594，95%CI 1.256－1.741，P＜0.000）。用多元Logistic回归分析校正了年龄、高血压、高血脂、体重指数和吸烟等危险因素的影响后，a等位基因是糖尿病合并颈动脉粥样硬化的遗传危险因素（OR＝0.717，P＜0.001）。证实eNOS基因VNTR多态性是影响汉族人群中糖尿病患者发生颈动脉粥样硬化的独立危险因素。结论 在汉族人群中糖尿病合并颈动脉粥样硬化的发病与内皮型一氧化氮合酶（eNOS）第4内含子a等位基因密切相关。

内皮型一氧化氮合酶 基因多态性 糖尿病 颈动脉粥样硬化

动脉粥样硬化和心脑血管疾病密切相关， 其中颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis）被认为是缺血性卒中的重要危险因素之一［1］。 颈动脉粥样硬化是全身性动脉粥样硬化的局部表现，是脑血管病的重要原因之一［2］，也是糖尿病并发大血管病变的主要并发症之一。 糖尿病并发颈动脉粥样硬化的发病率很高，其发生发展受许多因素影响，如吸烟、肥胖、脂代谢异常和高血压等。有研究表明这些已知危险因素仅增加糖尿病患者的心脑血管疾病发病率的25%～30%［3］，这说明在糖尿病合并颈动脉粥样硬化的发病机制中还有其他因素起着重要作用。已有研究证实，一氧化氮（nitric oxide，No）是抑制动脉粥样硬化形成的关键因素［4］。而一氧化氮合酶 （endothelial nitric oxide synthase，eNOS）第4内含子基因数目可变性串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）多态性与NO的功能密切相关［5］。eNOS第4内含子基因数目VNTR多态性是否影响汉族人糖尿病合并颈动脉粥样硬化的发病尚需进一步研究证实。

1 对象与方法

1.1 研究对象 糖尿病（2型）并颈动脉粥样硬化组（病例组）：189例，男102例，女87例；年龄45～95岁，平均（60.4±8.1）岁。均来自2005～2009年青岛市市立医院神经内科住院患者。对照组：240例，男125例，女115例，平均年龄（58.3±5.6）岁，此组经体检、实验室及心电图检查，仅有糖尿病，排除颈动脉粥样硬化、脑血管疾病、心肌梗死、肝肾功能不良等情况。入组标准：①所有患者的糖尿病（2型）诊断均符合美国糖尿病联合协会的诊断标准［6］；②采用彩色多普勒超声仪确诊为颈动脉粥样硬化并确定狭窄程度。排除标准：①经颅脑TCD、头颅CT及MRI检查证实，排除脑卒中疾病；②心肌梗死病史；③急慢性感染、肿瘤或自身免疫性疾病患者及有明显的肝功能、肾功能障碍或心功能衰竭者。被检查者均以发现颈总动脉或（和）颈内动脉粥样硬化斑块为阳性，每例被检查者不计斑块数，只计例数。对所有研究对象记录临床特征如：民族、年龄、性别、血压、血脂、有无吸烟嗜好及体重指数等。

1.2 方法 试验前DNA的提取：前夜禁食12 h以上，次晨空腹抽取检查对象外周静脉血2 mL，经EDTA抗凝，用于提取基因组DNA。

1.2.1 基因型检测

1.2.1.1 基因组DNA提取 EDTA抗凝全血2，分离出淋巴细胞，经细胞裂解液裂解和蛋白酶K消化后，常规酚－氯仿抽提DNA。

1.2.1.2 多聚酶链反应（PCR）扩增目的片断 上游引物：5′-GCCCTATGGTAGTGCCTTGGCTGGA-3′； 下 游 引 物 ：5′-GAGGCTGCTCCTGCTACTGACAGCAC-3′。经过PCR扩增目的片断，实验方法与H.G.Wang相同［7］。取3 μL PCR扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上做垂直电泳，电压60 V，时间3 h，PCR Marker作参照，在0.5 μg／mL溴化乙锭染液中染色40 min后在紫外线灯下观察结果。

1.2.1.3 基因型的确定 PCR产物以2%琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色，紫外灯下确定基因型。

1.2.1.4 基因序列测定 不同基因型的扩增产物送上海生工公司测定DNA序列，明确VNTR长度和重复次数。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.5软件进行统计分析。为考察资料的可靠性对糖尿病合并颈动脉粥样硬化组和对照组的基因型分布进行 Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验；基因型频率和等位基因频率差异采用χ2检验；采用logistic回归计算OR值及其95%CI。检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 eNOS基因27 bp VNTR基因多态分型及结果判定标准 内皮细胞型一氧化氮合酶基因型多态性表现为数目可变的串联重复序列（variable number of tandem repeat，VNTR），5次重复等位基因的PCR扩增片段长420 bp和4次重复等位基因的PCR产物长393 bp。（见图1）共有3种基因型：aa，ab，bb。电泳后条带分为3种：只有393 bp条带为aa基因型，只有420 bp条带为bb基因型，同时有393 bp和420 bp条带的为杂合ab基因型。

2.2 临床特征 对糖尿病合并颈动脉粥样硬化组（病例组）和对照组样本的临床特征进行比较分析，结果发现：糖尿病合并颈动脉粥样硬化组的血压、血脂、体重指数、年龄及吸烟比例明显高于对照组（P＜0.05）；而两组间的性别构成相匹配（P＞0.05），差异无统计学意义。

2.3 遗传平衡检验 将病例组和对照组的eNOS各基因型频率代入 Hardy-Weinberg遗传平衡定律，进行群体代表性检验，结果显示eNOS各基因型频率与期望值基本吻合，Waldχ2值分别为3.50和0.02，P＞0.05，基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。

2.4 eNOS基因a／b多态性与糖尿病合并颈动脉粥样硬化的关联分析 糖尿病合并颈动脉粥样硬化组（病例组）组与对照组的ab基因型频率分别为15.21%和11.25%，两者比较有显著差异 （P＜0.05）。a等位基因频率在病例组为9.78%，较对照组（6.04%）明显偏高（P＜0.05）（见表1）。Logistic回归分析显示，4a等位基因与糖尿病合并颈动脉粥样硬化具有显著相关性 （OR＝1.594，95%CI 1.256～1.741，P＝0.000），a等位基因是糖尿病合并颈动脉粥样硬化的危险因素。

图1 PCR扩增结果电泳图谱

表1 eNOS基因型及等位基因频率分布的比较

表2 糖尿病合并颈动脉粥样硬化的多因素logistic回归分析

2.5 多因素条件logistic回归分析 多因素logistic回归分析去除血压、血脂、体重指数、年龄及吸烟后，4a等位基因与颈动脉粥样硬化仍相关 （OR＝0.717，95%CI＝0.547-0.987，P＝0.001）（见表2）。

3 讨论

NO是体内重要的抗动脉粥样硬化的分子［8］。NO半衰期很短，其生物合成完全依赖eNOS的催化，eNOS的表达直接关联产生NO的量［9］。eNOS基因多态性可能影响eNOS蛋白的功能及活性，降低NO的合成，加速动脉粥样硬化的发展，从而引发血栓形成及心脑血管疾病［10］。TSUKADA等［11］研究发现27 bp VNTR多态性与基础的内皮NO释放水平有关，带4a等位基因基础的内皮NO释放水平明显低于不带4a等位基因者。但是，WANG等［12］研究却得出不同结论：eNOS基因第4内含子的VNTR多态性与eNOS酶功能活性有关，4a等位基因携带者eNOS酶活性比4b等位基因携带者高7倍，血浆NO水平明显升高。eNOS基因多态性的效应可能最终要通过影响NO的生成来实现，但其具体机制还需要深入的研究。

Salimi等［13］研究发现eNOS基因第4内含子基因的多态性与冠状动脉粥样硬化有着密切联系，而eNOS基因第4内含子基因的多态性与血浆中NO的水平无关。Fatini等［14］研究已经发现eNOS基因第4内含子的a等位基因为颈动脉粥样硬化的危险因素。Fatma S等［15］研究亦认为：eNOS基因第4内含子的a等位基因可能为动脉粥样硬化发病的独立危险因素。Ji Hyun Park等［16］研究表明：在韩国人群中eNOS基因第4内含子的VNTR多态性与2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化有明显相关性；eNOS基因第4内含子的a等位基因可能为糖尿病患者颈动脉粥样硬化发病的独立危险因素。此结论与本研究结果一致。

本研究结果发现：在汉族人群中糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者的a等位基因频率高于对照组 （9.78%、6.04%），且差别有显著区别；4a／4b＋4a／4a基因型频率在糖尿病合并颈动脉粥样硬化组和对照组分别为 17.38%和 11.65%（χ2＝5.518，P＜0.05），有统计学差异。用多元Logistic回归分析校正了年龄、高血压、高血脂、体重指数和吸烟等危险因素的影响后，a等位基因是糖尿病合并颈动脉粥样硬化的遗传危险因素（P＝0.001，OR＝0.717）。证实eNOS基因VNTR多态性是影响汉族人群中糖尿病患者发生颈动脉粥样硬化的独立危险因素。同时我们还分析了一些临床特征与糖尿病合并颈动脉粥样硬化的关系，发现年龄、高血脂、吸烟和肥胖是在汉族人群中糖尿病合并颈动脉粥样硬化发生的重要风险因子。

本研究首次报道了汉族人群中eNOS基因27 bp VNTR多态性为糖尿病合并颈动脉粥样硬化发病的危险因素，但由于研究所选的样本具有地域限制，不能代表整体人群。所以，eNOS基因27 bp VNTR多态性是否与糖尿病合并颈动脉粥样硬化有密切关系还需多中心进一步研究。

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Association study between the polymorphisms of nitric oxide synthase gene and carotid atherosclerosis in type 2 diabetic in the Chinese Han population.

LU Ruichun， WANG Hao， YU Jintai， TAN Lan.Department of neurology，Qing Dao Municipal Hospital，Qingdao 266071，China.Tel：053－288905686.

Objective To investigate the association between 27-base pair repeats polymorphism in intron 4 of eNOS gene and carotid atherosclerosis in type 2 diabetic in the Chinese Han population. Methods The two polymorphisms were analyzed in 189 patients of carotid atherosclerosis in type 2 diabetic and 240 controls of Chinese origin using polymerase chain reaction and its products were directly sequenced. Results The eNOS4a allele distribution frequency of eNOS gene in carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group（9.78%）was higher than that in control group （6.04%）， and4a／4b＋4a／4a distribution frequency of eNOS gene in carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group （17.38%） was also higher than that in control group （11.65%）.Both differences between carotid atherosclerosis in type 2 diabetic group and control group were significant（all P＜0.05）.Marker eNOS4a allele was found associated with carotid atherosclerosis in type 2 diabetic（OR＝1.594，95%CI＝1.256－1.741，P＝0.000）.After adjusted，a association was observed for eNOS4a allele using multivariate logistic regression analysis（P＝0.001，OR＝0.717）.Conclusions eNOS gene promoter polymorphisms are associated with ischemic stroke.the eNOS4a allele may rise the risk of carotid atherosclerosis in type 2 diabetic patients in the Chinese Han population.

Nitric oxide synthase Polymorphism Diabetes mellitus Carotid atherosclerosis

R743.3

A

2011－03－11）

（责任编辑：李立）

* 青岛市市立医院神经内科（青岛 266071）

△ 青岛大学医学院附属医院

（Email：dr.tanlan＠163.com）