白血病的分子生物学诊断研究进展

张耀辉

(淄博市中心医院，山东淄博，255036)

白血病是一类常见和多发的造血干细胞克隆性恶性疾病，形态学分型为其主要诊断方法，但对于一些形态不典型的病例易误诊。近年来临床研究发现，大部分的白血病存在着某种染色体易位，而易位会产生新的融合基因、癌基因的扩增、原癌基因点突变或抑癌基因的失活等。分子生物学技术应用于白血病的基因诊断已成为研究热点，现将其研究进展综述如下。

1 诊断策略

基因诊断是利用分子生物学的技术方法检测受检者体内DNA或RNA的结构或者水平的变化，从而对疾病作出诊断的方法［1］。与传统方法相比较，其具有非常显著的优越性，既可以直接对个体基因状态进行检测，又可以对表型正常的携带者以及特定疾病的易感者作出诊断和预测［2］。

在分子水平诊断白血病主要针对特定的染色体易位和易位形成的融合基因，如急性非淋巴细胞白血病(ANLL)M2b型存在AML1/ETO融合基因，为t(8;21)(q22;q22)易位所产生;M3型存在PML/RARα融合基因，是t(15;17)(q22;q21)易位所产生的;慢性粒细胞性白血病(CML)存在的bcr/abl融合基因由t(9;22)(q34;q11)易位所产生的;急性淋巴细胞白血病(ALL)则存在IgH、TCRγ、TCRδ等基因重排。髓系细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的重排基因以及融合基因为分子生物学诊断白血病提供了分子靶标，使其能有效进行白血病的分型诊断、微小残留病(MRD)的监测及疗效评价［3］。

2 诊断方法

2.1 荧光原位杂交技术(FISH) 目前FISH广泛用于检测染色体重组和标记染色体，检测多种基因疾病的染色体微缺失和用于非整倍体疾病的产前诊断［4，5］。其基本原理是用标记了荧光素、生物素或者地高辛的单链DNA探针和与其互补的DNA退火杂交，通过检测附着在玻片上的分裂中期或间期细胞上的核DNA位置反映相应基因的状况。适用于多种临床标本(如血液、骨髓、组织印片和体液，甚至石蜡包埋的组织标本等)，具有直观、方便、敏感、可量化、方法多样和适应不同检测目的等优点，目前在血液学领域中得到越来越广泛的应用，尤其是在白血病诊断、治疗监测、预后评估和微小残留病检测等诸方面为不可缺少的重要手段。

目前，可通过检测已经被克隆的染色体易位累及的融合基因对白血病进行分子诊断。常见的单一序列探针有PML/RARα、AML1/ETO、BCR/ABL和 TEL/AML1等。但是为了方便起见，商品化的探针可为多标记的，即两个基因分别用两种颜色进行标记，同时在一张玻片标本上进行杂交，可大大提高检测效率。间期FISH技术检测的是单个细胞水平上的染色体异常，可提供白血病负荷的数量指标，且可反映各期细胞的白血病残留状态，因此在国际上被广泛运用。杜庆锋等［6］应用双色双融合间期荧光原位杂交(D-FISH)探针对移植后或经供者淋巴细胞输注治疗获完全细胞遗传学缓解的慢性粒细胞白血病患者骨髓内残留的微小肿瘤负荷水平进行检测，结果显示D-FISH具有很好的灵敏度及特异性，可重复性高，并且检测到的阳性结果与RT-PCR结果高度相关。

2.2 实时荧光定量PCR技术(RQ-PCR)RQ-PCR技术是在常规的PCR反应体系中加入荧光染料或者荧光标记探针，然后通过荧光定量PCR仪检测PCR过程中荧光强度的变化情况，再根据标准品的Ct值(即PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数)来建立标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其具有灵敏、特异、技术成熟和操作简便等优点，检测白血病融合基因结果准确稳定，对于临床上明确诊断、具体分型、动态观测肿瘤负荷、选择合适治疗方案、评估治疗效果和预后都有较大价值。姜艳梅等［7］对RQ-PCR进行了方法学评价，在应用其检测急性髓系白血病AML1/ETO融合基因时，结果显示6例阴性AML1/ETO融合基因标本均呈现阴性，说明其特异性好，可重复性高。Uckun等［8］在用不同方法检测ALL患儿的t(4;11)染色体易位时发现，RQ-PCR既具有较核型分析和巢式RT-PCR更高的敏感性，又可定量分析。

2.3 基因芯片技术 基因芯片技术是将大量探针有序地固定在固相支持物上，与待测样本中的多种类核酸按碱基配对原则进行杂交，再通过电子计算机控制点样和图像扫描硬件及软件分析，迅速得出待测样本生物信息的分子生物学和遗传学结果的方法。其优越性为能够在基因表达水平上对肿瘤进行更精确的分型分类，并可预测肿瘤的治疗效果和预后。

随着人类基因组测序的完成，借助基因芯片技术，目前可得到不同类型肿瘤的转录基因表达谱(GEP)。近年来，应用基因芯片技术进行白血病的GEP研究报道较多，但用于临床诊断的基因芯片尚未问世，仍处于研究探索阶段。目前一个国际性肿瘤合作研究组(MILE)正在对基因芯片在白血病诊断分型方面的可靠性、敏感性和特异性进行评估，其有望改变白血病的诊断和分类格局，甚至成为白血病分子分型的必备工具［9］。

综上所述，FISH、RQ-PCR或基因芯片检测融合基因和基因重排，可用于白血病和微小残留病(MRD)分子生物学监测，在恶性血液病诊治中发挥着越来越重要的作用，尤其对一些骨髓形态学检查并不十分典型的白血病，通过检出其特征性染色体的改变，可提高疾病的诊断率。白血病的分子生物学诊断既可以弥补形态学(M)、免疫学(I)和细胞遗传学(C)检查的不足，又能够发现新的亚型。白血病相关基因的分子生物学检测不仅诊断达到分子水平，而且可以了解患者的白血病细胞负荷情况，并及时制订合适的治疗方案，极具临床应用价值。

［1］府伟灵.基因诊断治疗与预测医学［J］.第三军医大学学报，2009，31(1):24-25.

［2］Zechi-Ceide RM，Jesus-Oliveira NA，Guion-Almeida ML，et al.Clinical evaluation and COL2A1 gene analysis in 21 Brazilian families with Stickler syndrome:identification of novel mutations，further genotype/phenotype correlation，and its implications for the diagnosis［J］.Eur J Med Genet，2008，51(3):183-196.

［3］Campana D.Minimal residual disease studies in acute leukemia［J］.Am J Clin Pathol，2004，122(l):47.

［4］Pinkel D，Landegent J，Collins C，et al.Fluoresence in situ hybridisation with human chromosome specific libraries Detection of trisomy 21 and translocations of chromosmoes 4［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85(23):9138-9142.

［5］Kuwano A，Ledbetter SA，Dobyns WB，et al.Detection of deletions and cryptic translocations in Miller-Dieker syndrome by in situ hybridisation［J］.Am J Hum Genet，1991，49(4):707-714.

［6］杜庆锋，刘晓力，宋兰林，等.双色双融合间期荧光原位杂交探针检测慢性髓系白血病的微小残留病状态［J］.中华内科杂志，2002，41(12):801-804.

［7］姜艳梅，袁宏，刘新光，等.应用实时荧光定量RT-PCR检测急性髓系白血病患者AML1/ETO融合基因的临床意义分析［J］.中国实验血液学杂志，2009，17(1):17-22.

［8］Uckun MF，Herman-Hattenk K，Crotty LM，et al.Clinical significance of mll-afl fusion transcript expression in the sbsence of a cytogenetically detectable t(4，11)(q21，q23)chromosomal translocation［J］.Blood，1998，92(3):810-821.

［9］Haferlach T，Kohlmann A，Bacher U，et al.Gene expression profiling for the diagnosis of acute leukemia［J］.Br J Cancer，2007，96(4):535-540.