HPLC-ELSD法测定抗感颗粒中绿原酸含量

张亚明

(江苏省盐城市第一人民医院,江苏盐城,224001)

抗感颗粒为金银花、赤芍、绵马贯众经加工制成的颗粒。具有清热解毒的功能,主治外感风热引起的感冒。绿原酸被认为是抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分,通常被作为定性定量的指标。《中国药典》2010年版采用薄层层析法对绿原酸进行定性鉴别,未收载测定含量的方法[1]。文献有采用薄层扫描法[2],RP-HPLC[3-4],HPLC法[5-8],二阶导数紫外光谱法[9]和分光光度法[10]测定绿原酸含量的报道。为有效控制抗感颗粒的质量,探索绿原酸含量测定新方法,本文对用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLCELSD)测定抗感颗粒中绿原酸含量的方法进行了研究。

1 仪器与试药

LC-10AT vp型高效液相色谱仪(日本岛津公司),Varian 380-LC型蒸发光散射检测器(美国瓦里安公司),SPD-10A vp型紫外检测器(日本岛津公司)HW-2000色谱工作站,AS230自动进样器,AT330柱温箱,CA-3型静音无油空气泵,BP211D电子天平,6171型pH/mv测试器,CQ-250型超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)。

绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110753-200413,供含量测定用),抗感颗粒(贵州盛世龙方制药股份有限公司,批号:20090612,20090628,20090705);乙腈为一级色谱纯,水为重蒸馏水;其他化学试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Lichrospher C18,4.6 mm×150 mm,5 μ m;流动相:0.5%冰醋酸水溶液-乙腈(75:25);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;进样量:20 μ L。ELSD 条件:漂移管温度为90 ℃,载气1.6 Bar。理论板数按绿原酸峰计算不低于2000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备:精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12h以上的绿原酸对照品50.18 mg,置50 mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2.2 供试品溶液的制备:取本品,研细,取约1 g,精密称定,置具塞棕色瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,密塞,称定重量,超声处理(功率250 W,频率 40 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取滤液,用微孔滤膜(0.45 μ m)滤过,取续滤液,置棕色瓶中,即得。

2.3 标准曲线的制备

分别精密量取2.2.1中的对照品溶液2 mL、3 mL、4 mL 、5 mL 置10 mL的量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。取以上4种浓度溶液及2.2.1中的对照品溶液各20 μ L注入液相色谱仪,测定。以峰面积的对数值与浓度的对数值进行线性回归,得回归方程LogC=0.63512LogA-4.4523,r=0.9997,表明浓度在0.2～1 mg/mL内线性关系良好。

2.4 稳定性实验

取同一样品溶液,每隔2 h进样1次,测定5次,相对标准偏差(RSD)为0.63%。

2.5 回收率试验

分别精密量取2.2.1中的对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL置10 mL的量瓶中,加供试品溶液稀释至刻度,摇匀。取以上3种浓度溶液各20 μ L注入液相色谱仪,测定。每种浓度连续进样3次,取其平均值计算。结果平均回收率为99.5%。

2.6 精密度试验

精密量取2.2.1中的对照品溶液5 mL置10 mL量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,重复进样6次,RSD为0.35%。

2.7 样品含量测定

取 2.2.2 供试品溶液 ,滤过 ,进样 20 μ L,按2.1条件测定,用2.3回归方程计算供试品的含量,测定3批样品,平行测定4次,3批样品的含量平均值分别为99.8%、99.6%、99.8%,RSD分别为0.39%、0.48%、0.44%。

3 讨 论

抗感颗粒可清热解毒,用于外感风热引起的发热、头痛、鼻塞、喷嚏、咽痛、全身乏力、酸痛等症[11-12]。抗感颗粒中的主要成分金银花药用历史悠久,为常用的清热解毒药,它的作用广泛,具有清热解毒、散风消肿的功能,主治风热感冒、肺炎、咽喉肿痛、急性细菌性痢疾、婴幼儿腹泻等证。金银花属于忍冬科,主要含有绿原酸、异绿原酸、挥发油、咖啡酸、黄酮、皂苷等。按2005版中国药典规定,金银花中的标志性成分是绿原酸和木犀草苷,绿原酸常作为金银花质量控制的指标成分[13-14]。因为绿原酸和木犀草苷的最大吸收波长不致,所以需要分别用HPLC法测定绿原酸和木犀草苷的含量,增加了检测工作量。

ELSD是一种通用质量型检测器,可以克服紫外检测器的以上缺点,对测定条件下所有通过漂移管仍未蒸发的气化的固体颗粒都会响应,因而对持续通过漂移管的流动相要求应全部挥发。因此本文采用ELSD检测器对其进行同时测定,研究结果显示,应用ELSD检测器,可充分排除流动相紫外吸收对含量测定的影响,此法准确,精密度、重现性好、回收率高,为金银花药材的质量控制提供了快速、准确的测定方法。研究发现载气流速和漂移管的温度对ELSD的检测性能有较大影响,在仪器规定的参数范围内经反复实验,最终确定ELSD检测器的参数为漂移管温度为90℃,载气1.6 Bar。在实验中,我们选择了醋酸-水-乙腈体系,将绿原酸有效洗脱出来,且可全部挥发以减少其对测定的影响。蒸发光检测器灵敏度较高,检出限可达10 ng。在本实验条件下,绿原酸的检测限为30 ng(S/N=2),完全能够满足检测要求。此色谱条件可同时用于含绿原酸的其它中成药的含量测定。亦可用于这类药物的鉴别。

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