破骨细胞分化刺激因子在佐剂性关节炎大鼠滑膜中的表达及意义

石国勋，郑祥雄，任天丽

(1无锡市第二人民医院，江苏 无锡 214002;2福建医科大学附属协和医院)

研究发现，类风湿关节炎(RA)滑膜中破骨细胞的大量形成是引起RA软骨和骨破坏的关键因素。破骨细胞分化刺激因子(ODF)为NF-κB配基受体激活剂，与骨保护素(OPG)一起是调节破骨细胞形成和活化的重要因子［1］。2005年1月～2006年7月，本实验用佐剂性关节炎(AA)模型模拟人RA的早期临床表现，研究滑膜中ODF基因表达与破骨细胞形成和活化的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SD大鼠20只，雌性，体质量为(200±10)g，由上海实验动物中心提供。Trizol试剂为Gibco公司产品，RT-PCR试剂盒为Promega公司产品，完全弗氏佐剂、TRAP染色试剂盒为 Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 AA大鼠模型的制备 20只SD大鼠随机分为两组各10只，麻醉后一组于右足垫皮下注射完全弗氏佐剂0.1 ml(模型组)，另一组大鼠注射0.1 ml的生理盐水(对照组)。

1.2.2 滑膜及其关节的组织病理学检测 于模型制备后30 d断头处死大鼠，分离病变的膝关节，经脱钙、脱水，常规石蜡包埋切片、HE染色。同样方法处理对照组大鼠关节滑膜组织。

1.2.3 滑膜组织总RNA抽提 提取滑膜组织，Trizol试剂盒提取RNA，干燥后用DEPC处理的去离子水50 μl溶解RNA，用核酸紫外分析仪检测RNA的含量。

1.2.4 RT-PCR 法检测滑膜中 ODF、OPG、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)基因表达 按照逆转录试剂盒步骤逆转录合成cDNA，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。凝胶电泳经Fuji Film图像处理，输入Image Master VDS凝胶成相系统做灰度扫描，进行基因表达强度分析。结果以目的条带与内参照β-actin的灰度比值表示。

1.2.5 滑膜组织破骨细胞TRAP染色 用TRAP染色试剂盒进行组织化学染色，按说明书进行操作。常规脱水、封片，镜下观察结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件;实验数据用表示，组间比较采用成组t检验;各指标间的关系用Spearman相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病变膝关节HE染色 致炎30 d后，AA大鼠关节滑膜增生，滑膜衬里层增厚，滑膜细胞增生肥大，成绒毛状排列紊乱，向关节腔内突出。在滑膜和软骨交界处有新生血管翳形成，各种炎性细胞浸润，软骨和骨被破坏。

2.2 ODF、OPG、TRAP基因表达 AA大鼠滑膜组织中ODF mRNA和TRAP mRNA的相对表达水平分别为0.880 ±0.056 和0.681 ±0.050，而对照组分别为0.109 ±0.013 和0.093 ±0.014，两组相比有统计学差异(P均＜0.01);OPG mRNA对照组和AA组分别为0.231 ±0.051、0.253 ±0.043，两组相比无统计学差异(P＞0.05)。经相关性分析，TRAP的表达水平与 ODF/OPG呈正相关(r=0.932，P＜0.01)。

2.3 滑膜组织破骨细胞TRAP染色 TRAP染色显示，在滑膜组织和滑膜—软骨交界处及侵蚀软骨表面增生的单个核和多个核且胞质内有深红色颗粒沉淀，即为 TRAP阳性的破骨或破骨前提细胞。Spearman相关分析表明，AA大鼠病变膝关节石蜡切片中TRAP阳性细胞的数量与软骨损伤的程度呈正相关(r=0.941，P ＜0.01)

3 讨论

AA模型是一种免疫炎症性模型，在临床和病理上有着与人RA相似的特点，可以作为人类RA较为理想的疾病模型［2］。在病理切片上，AA组大鼠关节囊内滑膜增生，新生血管翳形成，并有大量炎症细胞浸润、软组织水肿、关节间隙增宽，软骨和骨破坏，与文献［3］报道一致，说明AA模型成功，在一定程度上可以反映RA活动期的表现。

目前，对于破骨细胞的激活和增殖信号传导有两个途径，主要途径是ODF/RANK/NF-κB或蛋白激酶JAK通路［4］，次要通路是炎症因子非 ODF/RANK依赖通路。如IL-1、TNF等炎症因子可诱导单核巨噬细胞系分化为有功能的破骨细胞ODF及其转换受体(RANK)，是肿瘤坏死因子受体超家族成员，具有刺激破骨细胞前提细胞分化为破骨细胞的功能，并可延长其生存时间［5］。OPG是一种分泌性蛋白，是ODF的诱骗受体，和RANK共同竞争与ODF结合，抑制ODF的生物学活性。本研究显示，AA组大鼠滑膜中大量表达ODF，而在正常组则表达很少，OPG的表达两组则无明显差别。同时我们也检测到破骨细胞的标志TRAP的表达与ODF表达一致，说明了ODF的表达与破骨细胞的形成和活化有关。

［1］Nakano K，Okada Y，Saito K，et al.Induction of RANKL expression and osteoclast maturation by the binding of fibroblast growth factor 2 to heparan sulfate proteoglycan on rheumatoid synovial fibroblasts［J］.Arthritis Rheum，2004，50(8):2450-2458.

［2］Akiyama T，Mori S，Mashiba T，et al.Incadronate disodium inhibits joint destruction and periarticular bone loss only in the early phase of rat adjuvant-induced arthritis［J］.J Bone Miner Metab，2005，23(4):295-301.

［3］Egan CG，Lockhart JC，Ferrell WR.Pathophysiology of vascular dysfunction in a rat model of chronic joint inflammation［J］.J Physiol，2004，557(Pt 2):635-643.

［4］Sabokbar A，Kudo O，Athansou NA.Two distinct cellular mechanisms of osteoclast formation and bone resorption in periprosthetic osteolysis［J］.J Orthop Res，2003，21(2):73-81.

［5］Bugress TL，Qian Y，Kaufman S，et al.The ligand for osteoprotegerin directly activates mature osteoclast［J］.J Cell Biol，1999，145(1):527-538.