近红外光谱技术对胶质瘤大鼠优化散射系数的研究

郭 凯，杨天明*，钱志余，张立国，刘华亭

(1东南大学附属中大医院，南京210009;2南京航空航天大学)

胶质瘤起源于神经外胚层，是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤(约占30%)。目前胶质瘤的无创定位方法主要是MRT、CT、PET，然而胶质瘤呈浸润性生长并与脑组织无明显分界，传统的检测方法所检测到的肿瘤边界随着术中脑位置变化和脑脊液改变而变化，因此，为尽可能切除肿瘤细胞需要开发一种新的检测方法来更好地定位肿瘤范围［1，2］。近红外光谱技术将空间分辨率提高到单细胞分子水平，以无创或微侵袭、准确度高的特点逐渐应用于临床肿瘤的诊断。本实验于2010年3～11月利用近红外光谱采集系统实时在位采集C6胶质瘤大鼠的优化散射系数，通过对其分析来判断脑组织类型，为胶质瘤研究提供一种新的实时诊断技术。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料 江湾I型C动物立体定向仪，微创近红外组织参数测试系统，特制的Y型双光纤微探头，卤素光源，光谱仪，自动步进系统，MID－7604步进电机驱动器，PCR－7344控制器，计算机及相关软件。

1.2 细胞与动物 大鼠C6胶质瘤细胞(购自中国科学院上海细胞库)，培养于5%CO2、37℃培养箱，培养基为加入15%马血清及2.5%胎牛血清的F－12K培养液。在细胞对数生长期大约满85%时，以0.25%胰酶消化，收集消化液，离心后去除上清液，F－12k液洗2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度至1×107～1 ×108/10 μl，置于 33 ℃恒温摇床待接种。苔盼蓝排斥实验检测细胞活力＞95%。选取健康成年Sprague Dawley(SD)大鼠(购自南京青龙山实验动物养殖中心)40只，体质量250 g，雌雄不限，随即选取20只建模，另外20只作为正常对照组。

1.3 实验方法

1.3.1 胶质瘤大鼠模型的建立及鉴定 大鼠术前12 h禁食禁水，麻醉前30 min肌肉注射阿托品0.05 mg以抑制呼吸道分泌，并在实验过程中每小时肌肉注射阿托品0.05 mg维持。腹腔注射1%戊巴比妥进行麻醉，体温控制在37.5℃。麻醉后将大鼠固定于江湾Ⅰ型立体定向仪上，暴露前囟，以前囟为原点，向后1 mm、中线向右旁开3.0 mm，用牙科磨钻打一直径1 mm小孔。微量进样针将10 μl细胞悬液缓慢注入硬脑膜下5 mm处的脑组织中，停针5 min后退针，骨蜡封闭骨孔，清洗切口后缝合。常规饲养14 d后将大鼠用常规剂量戊巴比妥钠麻醉，用7.0 T德国bruker公司生产实验小动物专用磁共振仪行平扫。

1.3.2 胶质瘤大鼠的优化散射系数测定 将胶质瘤组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，固定于立体定向仪框架，将三维坐标调零。常规消毒后切开头皮约1.0 cm，剥离骨膜，用牙科磨钻在原建模时的骨孔处打一直径3 mm的小孔，利用生物组织近红外光谱自动测试系统，在骨孔处进行近红外光学参数测量。微创光纤探头以硬脑膜为测试零点，并在立体定向仪的定位和步进电机控制下开始活体在位测量相关参数(测量步长0.1 mm，测量深度约6 mm)。测量结束后缓慢退出近红外探头，钻孔使用骨蜡覆盖，常规缝合伤口，整个过程在超净工作台内进行，术后无需抗生素防治感染，术后对大鼠行MRI扫描。扫描后麻醉处死大鼠，取脑固定于10%福尔马林溶液24 h以上，石蜡包埋，切片，HE常规染色。正常对照组大鼠的优化散射系数测定步骤同上。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组内行单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRI结果 正常对照组大鼠脑组织可以清晰看出微创光纤探头从硬脑膜开始经皮层、白质然后到达基底节区。胶质瘤脑组织可看到胶质瘤呈椭圆形侵犯整个右侧基底节区域及白质部分，并越过中线挤压左侧基底节区域的脑组织而且伴有脑水肿。

2.2 HE染色结果 胶质瘤大鼠处死后取脑切片行HE染色，左侧蓝染区域可见C6胶质瘤细胞聚集，右侧淡染区域为正常组织并明显可见C6胶质瘤细胞浸润。

2.3 优化散射系数测量结果 胶质瘤大鼠的优化散射系数一维曲线较为平直、稳定。在波长690 nm处对照组和C6胶质瘤组优化散射系数分别为(19.86±0.86)、(17.69±1.70)cm－1(P ＜0.05)。

3 讨论

近红外光谱技术是近几年发展的一种检测组织结构性质和动态功能的新技术。目前应用于多种病理生理状况下脑组织的监测，但是大多是用于监测脑组织血流动力学改变或脑氧代谢，用于脑组织类型的精确识别及病理情况下检测的研究较少。杨天明等利用近红外光谱技术通过探头穿刺过程中的近红外光反射系数R推算脑组织光学参数，证实了脑灰质与脑白质间光学特性有差异。相对于正常脑组织，脑胶质瘤含有较低的脂质及大量的髓鞘增生［1］。肿瘤的生物学行为受诸多因素影响，如瘤体的血管生成和能量代谢等。瘤体的形成过程中，血管生成因子过度表达，血管生成迅速，部分管壁不完整甚至出血坏死［3］。而肿瘤的能量代谢分为有氧代谢和无氧代谢，Ⅱ～Ⅲ级C6胶质瘤多为有氧代谢，能量代谢率较高［4］。因此，当脑组织结构及组成成分发生变化时对光的散射特性也会出现变化，优化散射系数可反应出这种变化。优化散射系数既是组织结构的固有光学特征，又能反映与神经元活动相关的变化，且受组织内血流量、血红蛋白及水含量等影响小，与吸收系数相比数值相对稳定，宜作为组织定位时的特征参数。在高散射介质的生物组织中(如脑组织)优化散射系数远大于吸收系数，故优化散射系数更稳定，对变化更敏感。

本实验我们用特制的内置双光纤微针管样探头［5，6］微创实时在位监测C6荷瘤鼠脑基底节区肿瘤的优化散射系数，并与对照组比较，结果表明C6荷瘤鼠基底节区肿瘤的优化散射系数明显低于对照组。由此证实近红外光谱技术对胶质瘤的诊断具有安全可靠、连续实时、便捷、低成本、无创、操作时程短和对人体生理状态影响小等优点，具有较高的应用价值。

［1］Amharref N，Beljebbar A，Dukic S，et al.Brain tissue characterisation by infrared imaging in a rat glioma model［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1758(7):892－899.

［2］Krafft C，Sobottka SB，Schackert G，et al.Near infrared Raman spectroscopic mapping of native brain tissue and intracranial tumors［J］.Analyst，2005，130(7):1070－1077.

［3］ Tuettenberg J，Friedel C，Vajkoczy P.Angiogenesis in malignant glioma－－a target for antitumor therapy［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2006，59(3):181－193.

［4］Pasdois P，Deveaud C，Voisin P，et al.Contribution of the phosphorylable complex I in the growth phase－dependent respiration of C6 glioma cells in vitro［J］.J Bioenerg Biomembr，2003，35(5):439－450.

［5］钱志余，陈仁文，顾月清，等.生物组织光学参数:优化散射系数(μ’s)的实时在位测定［J］.南京航空航天大学学报，2004，36(3):369－372.

［6］钱志余，顾月清，刘汉莉，等.实时在位测定大鼠脑组织优化散射系数(μ’s)的技术研究［J］.中国医学物理学杂志，2005，22(2):463－465.