P16在子宫颈病变中的应用研究进展*

薛迎峰 乔云波

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤。在全世界导致妇女死亡的恶性肿瘤中排第二位[1]。分子流行病学调查证实，宫颈癌中99%以上由高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染所致。感染HPV后，多数可自然清除，少数发展为CIN，只有很少的人最终会发展为浸润性宫颈癌。诸多因素包括机体免疫水平在内都会影响感染的最终结局。Serrano等于1993年首先克隆出了p16基因的cDNA，编码相对分子质量为16ku的蛋白质，被命名为p16基因[2]。通过对p16基因研究的不断深入，有人认为p16在抑癌方面的重要性甚至超过p53和Rb(Retinablastoma gene)基因[3、4]。HPV感染宫颈细胞并诱导癌变中，细胞周期发生功能紊乱，其中P16INK4a可作为一个非常有效的宫颈细胞核异常的生物学标志物，来预测CIN的发生、发展、转归以及预后，用P16INK4a在CIN组织中的表达来发现和标识潜在病情发展的高危患者，对其进行合理的治疗及密切随访，减少低危患者的过度治疗及不必要随诊，对临床具有重要价值。

1 P16INK4a

1、1 P16位点的基因组结构

P16基因位于人类染色体9P21，长8.5 kb，包含2个内含子和3个长度分别为126 bp、307 bp和11 bp的外显子[5]。P16蛋白N端与细胞周期蛋白(cyclin)p-box的N端具有部分同源性[5]。P16蛋白的锚蛋白重复序列是与目标分子相互作用的物质基础，对P16的抑癌功能非常重要是维持其活性所必须的结构，锚蛋白重复序列与CDK的相互作用可以抑制细胞周期素D(cyclin D)的活性，在它序列之外的缺失对P16基因突变体蛋白产物的功能无明显影响[6]。

1、2 P16蛋白抑癌功能的作用机理

P16抑制细胞周期的作用主要通过cyclinD-CDK4/6- pRb-E2F途径来实现。CDK本身没有活性，只有与细胞周期素(cyclin)结合或亚单位磷酸化后才具有活性，在cyclin中最重要的是cyclinD。CDK4/6与合成的cyclinDl结合被激活，激活后的CDK4/6-cyclinDl复合物具有催化活性，可使pRb磷酸化，并且可通过各种途径调节磷酸化的活性，磷酸化后的pRb失去对转录因子E2F的抑制能力，诱导E2F依赖性基因的转录，这些基因的产物促进DNA的合成和细胞的分化，使细胞通过G1-S期，进入S期。CDK受到抑制就不能磷酸化pRb，低磷酸化的pRb不能与E2F分离，促进DNA合成的基因转录受到阻止，这样非磷酸化或低磷酸化的pRb可阻止细胞由G1期进人S期。由抑癌基因pl6编码的P16蛋白可以与cyclinD竞争性结合CDK4/6，结合后CDK4/6的活性被抑制，pRb不能磷酸化，阻止DNA的合成使细胞停滞在G1期。如果CDK得不到抑制，则导致细胞不断增殖[7]。然而P16在cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F细胞周期调节途径中起负反馈调节作用，当高磷酸化的pRb增多会诱导P16INK4a的高表达，又可通过与CDK4/6结合减少pRb的磷酸化，调节细胞周期平衡，阻止肿瘤发生。细胞分裂次数的积累和癌基因的激活，使P16INK4a的表达在转录水平上提高。当表达水平足够高时就能抑制细胞分裂，诱导细胞凋亡，从而防止细胞无限制分裂。同时细胞处于恶劣环境或DNA受到损伤时，P16INK4a的表达水平也上升，以防止异常细胞进人细胞周期。

1、3 P16INK4a的失活

P16INK4a失活的原因主要有4种:(1)纯合性缺失，约占人类肿瘤的14%。(2)杂合性缺失。(3)基因内突变，约占人类肿瘤的5%。(4)启动子的甲基化，主要发生在INK4a的启动子上，导致INK4a转录活性完全丧失，约占人类肿瘤的19%[8]。TriPathi A[9]对46例宫颈癌患者的标本进行检测后发现，P16基因的失活率为33%。其中甲基化率为15%，突变率为6.5%，纯合子缺失率为8.7%。

2 P16INK4a与HPV感染的关系

通过免疫组织化学方法测得，P16在宫颈癌中的表达与其他肿瘤不同，存在P16蛋白的高表达，且随着宫颈癌病情的发展呈现逐渐升高的趋势[10-11]。有学者认为P16在宫颈癌中的高表达可能与HPV的感染有关。Ishikawa等[12]应用PCR技术检测CINⅠ、CINⅡCINⅢ及SCC中hr-HPV的感染率，结果分别为69.8%(37/53)、97.5%(39/40)、91.7%(44/48)和100%(16/16)；并应用免疫组织化学方法同时检测hr-HPV阳性的CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和SCC中P16表达阳性率分别是32.4%(12/37), 82.1%(32/39), 93.2%(41/44)和100% (16/16)。分析因为在P16INK4a-cyclinD1-CDK4/6- pRb精细调节级联中，P16INK4a可通过负反馈调节机制表达上调, pRb-E2F复合物抑制基因P16INK4a本身的转录，所以无论是通过点突变还是蛋白与蛋白之间的相互作用导致pRb功能的丢失，都会使P16INK4a失去负反馈抑制，其转录和翻译会相应提高。而表现为过表达。

3 pl6INK4a与临床

3、1 P16在宫颈癌筛查中的应用

现在宫颈癌的早期筛查多用hr-HPV或细胞学联合检测，已有文献报道为了避免形态学诊断的主观性同时用P16检测以提高准确性。Pientong等[13]比较了165例宫颈细胞学检查中P16免疫细胞染色，同时研究P16过表达和HR-HPV感染的关系，检测结果NILM、ASCUS、LSIL、HSIL和SCC中P16阳性率分别为：0，52.5%，54.3%，100%和100%，HPV阳性率分别为10%，45%，57%，70%和86.7%。而且在hr-HPV阳性的HSIL和SCC中，P16过表达率均为100%。因此，宫颈细胞学检查联合P16免疫细胞化学染色更为准确、实用。P16过表达可以看做是hr-HPV感染细胞后启动癌变程序标志，可以协助HPV检测对宫颈上皮内高度病变预测假阳性率高和细胞学检测假阴性率高的不足，而且其检测方法简单、经济，易于操作，因此，P16INK4a将会成为一种很有前途的生物学标志物。

3、2 P16在宫颈病变诊断及鉴别诊断中的应用

目前宫颈病变的病理诊断受主观偏差影响，其结果差异较大导致临床治疗不足或过度治疗，而且CINⅠ和CINⅡ的区别仅靠形态学诊断是不可靠的有时在形态学上符合低级别但生物学进程却符合高级别。Klaes等[14]随机挑选190例宫颈锥切标本， 5位病理学家分别阅片，组织病理诊断一致的仅有130例，其中浸润癌，CINⅢ、Ⅱ、Ⅰ的诊断符合率分别为94%，72%，35%和52%。可以看出,级别越低符合率越低。而通过免疫染色诊断的符合率均大于90%，为P16免疫组织化学方法作为宫颈病变活检病理诊断辅助检查提供依据。

3、3 P16在基因治疗中的应用

Arapn[15]用P16INK4a转染有pl6INK4a基因失活的癌细胞系，发现癌细胞生长出现抑制，这为用P16INK4a基因治疗肿瘤提供了线索。有学者认为P16INK4a基因分子较小，易于操作，作用对象单一，可特异性地抑制CDK4和CDK6，可以作为抗肿瘤药物具有专一性的靶子。以P16INK4a基因作为目的基因的基因替代治疗，以及针对pl6INK4a基因甲基化失活的治疗，将在包括宫颈癌在内的人类的基因治疗中具有广阔的应用前景。

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