调节性树突细胞与免疫负向调控*

王文文 刘焕星

(1.泰山医学院，山东 泰安 271000； 2.泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

树突状细胞(dendritic cells，DCs)是具有最强抗原提呈功能的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)，由于它能高水平表达MHCⅡ类分子且高效率提呈抗原，有强大的激活CD8+、CTL及CD4+T辅助细胞的能力，被认为是机体免疫应答的主要启动者，在免疫应答的诱导中发挥主导作用。近年来，随着对DC异质性的深入研究，DC在激活免疫应答的同时也可负向调节免疫应答强度，诱导免疫耐受这一特性逐渐引起人们重视。DC的异质性主要表现在其来源、表型和成熟状态的多样性，由此人们提出了调节性DC(regulatory DC，DCreg)的概念，DCreg具有负向免疫调节功能，在体内外诱导T细胞的低反应性，并诱导调节性T细胞(regulatory T cell ，Treg)的产生，参与免疫耐受的形成，并由此衍生出多种疾病如肿瘤、器官移植等的生物治疗方案应用临床治疗。

1 调节性DC的概述

1.1 调节性DCs与 DCs

DC起源于骨髓CD34+细胞，其数量不及外周血白细胞数量的1%，却发挥着至关重要的作用。实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型大脑中分离出大量表型为CD11b+CD11c+DCs，能促进调节性T细胞的增殖，抑制免疫应答[1]，突破了人们认为脑中没有DC分布的观点，使DC的分布范围扩展到了全身。体内DC主要分为髓系DC(myeboid-drived DC，DC1)和淋巴系DC(lymphoid-related DC，DC2)两大类。DC1、DC2的前体细胞经外周血，再分布到全身各组织，经历前体DC、非成熟DC、成熟DC的三个过程。DC作为体内专职抗原提呈细胞，其抗原递呈功能与其表面的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子及粘附分子的表达密切相关。MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子能与抗原肽结合，把抗原和免疫复合物分别递呈给CD8+、CD4+T淋巴细胞。调节性DCs是一群异质性的细胞群体，是具有免疫负向调节功能的DCs的总称，其表面标志具有多样性。研究[2]发现小鼠的调节性DCs高表达DCs的特异性标记CD11c及主要组织相容性复合体(major histocom-patibility complex，MHC)分子，低表达共刺激分子CD40、CD80、CD86。曹雪涛等[3]研究发现脾脏内皮细胞可以在某些因子作用下诱导脾脏成熟DC分化发育为一种表型为CD11cloCD11bhiMHC-Ⅱlow的新型调节性DC，可以通过分泌NO阻止T细胞反应，并且在体内找到了对应一群细胞，在受到LPS刺激后分泌NO与IL-10等抑制性因子，此外肝脏基质细胞能使CD117+Lin-HSCs分化发育为CD11cloCD11bhiMHC-Ⅱlo的调节性DC[4]。说明了既往被认为终末分化状态的成熟性DC可被诱导为具有抑制T细胞反应的调节性DC。Wong等[5]研究发现，调节性DCs表达低水平的CD11c和高水平的CD45RB，这些调节性CD11clowCD45RBhiDCs在疟原虫感染后上调CD11c的表达，阻止T细胞反应。可见调节性DC在控制免疫反应强度、维持机体稳态方面与DCs相比具有调和作用。

1.2 调节性DCs来源

体内DCs的含量极微，不能满足临床研究应用。如何体外扩增DCs并维持其处于负向调节免疫反应的功能状态成为其应用于临床的关键。目前文献报道关于调节性DCs的来源主要有以下几种方式：(1)体外应用细胞因子生物制剂。研究发现GM-CSF、IL-4、TGF-β等因子均可刺激DCreg产生。(2)应用化学药物诱导DC向DCreg转化或诱导DC产生免疫调节的作用。核因子κB被认为是DCs发育成熟的关键性调控基因，药物包括阿司匹林、维生素D3代谢产物1，25羟化维生素D3和它的类似物，葡糖胺、免疫抑制剂(糖皮质激素、环孢素A、雷帕霉素、脱氧精胍菌素和麦考酚吗乙酯等)均可抑制核因子κB，诱导出具有未成熟DCs表型的调节性DCs[6]。(3)不成熟DC转化为DCreg，肺脏基质细胞可诱导C57BL/6L来源的HSCs分化发育为一种表型特殊的调节性DC，从而诱导T细胞的低反应性。(4)通过凋亡细胞或CD8+CD28-抑制性T(CD8+CD28-T)细胞诱导DCreg生成[7]。干扰素-γ(IFN-γ)可上调DC表面吲哚胺2，3双加氧酶( indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)表达[8]，并通过CD8+CD28-T细胞的刺激作用促进DC表面免疫球蛋白样转录物( ILT3，ILT4)表达，以降低DC活化T细胞的能力，加强DC调节免疫耐受作用。(5)寡聚脱氧核苷酸(CpG)刺激或人白细胞G抗原介导生成DCreg。Bonham等[9]应用核因子κB寡聚脱氧核苷酸诱骗剂和联合使用腺病毒载体编码细胞毒T细胞相关抗原，使未成熟骨髓源性的DCs分泌潜在的阻滞共刺激分子的细胞因子。(6)神经肽(血管活性肠肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽)刺激诱导DCreg产生，Chorny等[10]利用DCs与血管活性肠肽共培养证实血管活性肠肽能非常有效的诱导调节性DCs的产生。上述刺激方式皆可降低DC的成熟度，减少DC细胞因子的分泌，减弱DC对T细胞的活化。也有报道[12]经脂多糖(LPS)刺激的成熟DC可引起Th2型反应从而降低实验性变应性脑脊髓炎的炎症反应(EAE)。

2 DCreg 诱导免疫负向调节的作用与效应机制

2.1 DCreg分泌具有负向调节免疫的细胞因子

(1)IL-10(细胞因子合成抑制因子)。IL-10是一种非常重要的与DCreg功能密切相关的细胞因子，它与DC的分化、成熟、免疫调控功能密切相关。IL-10是DC的自分泌细胞因子，不同DC亚群分泌IL-10能力不同。IL-10对DC的抑制效应体现在减少MHC-Ⅱ类分子、共刺激分子及细胞粘附分子的产生。能减少炎性细胞因子及IL-12的合成[13]，进而抑制T细胞增殖，产生IL-2及IFN-γ。此外，IL-10可有力地抑制活化的单核/巨噬细胞产生IL-1、TNF-α等致炎细胞因子及与免疫炎症细胞募集有关的趋化因子如MCPI、L28、IP-10等，还诱导天然抗炎分子如IL-lra的产生。(2)转化生长因子β(TGF-β)。TGF-β是一组调节细胞生长和分化的蛋白质，机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β，其主要生物学活性有抑制细胞增殖、对细胞表型的调节、抑制淋巴细胞的分化、抑制细胞因子产生等。TGF-β和IL-10一样，都属于强免疫抑制因子。有研究者发现TGF-β诱导后，DC表面协同刺激分子、MHC类分子表达下降，并明显抑制了混合淋巴细胞反应中同种异体T细胞增殖，说明TGF-β可以降低DC的成熟状态，进一步抑制T细胞活化、增殖。(3)一氧化氮(NO)。Sistiama等[14]在实验中发现，DC在暴露于自身循环蛋白、血清蛋白时，可表达高水平的诱导型一氧化氮合酶，从而促进NO的生成。NO作为一类重要的细胞信号分子，能激活初始T细胞，但抑制T细胞的增殖。(4)吲哚胺2，3-双加氧酶( indoleamine-2，3-dioxyge-nase，IDO)，许多细胞内都有IDO表达，如DC、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等。IDO在体内作用于色氨酸,是其代谢的限速酶，而色氨酸是T细胞尤其是抗原活化的T细胞增殖所必需的氨基酸，色氨酸的耗竭及其代谢产物的表达有利于抑制T细胞的增殖和活化[15]。Fogel-Petrovic等[16]研究证明调节性DCs可以表达环氧合酶1和环氧合酶2，并能自发合成地诺前列酮，介导免疫耐受。

2.2 DCreg与Treg相互作用

(1)DCreg诱导Treg生成 。Treg是一类在体内、体外对免疫具有调节(或限制)作用的T细胞。抗原特异性T细胞在DC的作用下最终分化成为辅助性T(Th)细胞1、Th2或Treg。Treg可分为CD4+CD25+Treg、Tr1和Th3等多种亚型。Treg特异性抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖，能够不表达或表达极低水平的增殖能力和细胞因子，并且通过非抗原特异性方式明显抑制效应性T细胞的增殖以达到免疫的负向调节作用，从而阻止自身免疫反应的发生。iDC能通过诱导抗原特异性CD4+和CD8+调节性T细胞(Treg)的形成抑制抗原特异性T细胞的增殖及活化，表达低水平MHC分子及共刺激分子的调节性DCs亚群，能为Treg提供适宜的刺激信号，例如Moseman等[17]报道寡聚脱氧核苷酸CpG基序可通过Toll样受体9信号识别通路有效激活pDCs，从而刺激naiveCD4+CD25-T细胞分化成Treg。DCreg可以分泌白细胞介素-10(IL-10)影响B细胞或者T细胞，引发免疫耐受。调节性T细胞与调节性DC均能分泌IL-10，因此具有彼此促进分化的作用，加强了DCreg的免疫调节/耐受作用，与此同时与Treg直接接触的DC不再刺激T细胞增殖，而是通过链式反应诱导更多的Treg。不过另有研究表明CD4+CD25+Treg可抑制mDC诱导的Th1型应答，且与DC分泌的IL-10无关。(2)调节性T细胞对DC的作用。Treg也能通过DC发挥免疫调节功能，Treg能通过共刺激分子作用于DC，使DC高表达IDO；Treg能诱导DC产生TGF-β，从而抑制效应T细胞的激活。nTreg可通过抑制DC的成熟来维持免疫耐受或免疫平衡，nTreg在DC周围大量增殖，通过LFA-1(淋巴功能相关抗原-1)和CTLA-4依赖的方式，下调CD80/CD86的表达，抑制DC激活效应性T细胞进而产生免疫耐受。DC与调节性T细胞接触后能升高具有免疫调节功能的DC上共刺激分子的表达，而这种DC反过来能诱导CD4+T细胞的无反应，从而建立一个限制性的反馈环，发挥免疫耐受作用。

3 DCreg在临床应用

3.1 DCreg与器官移植排斥反应及自身免疫性疾病的关系

DCreg具有下调免疫强度诱导免疫耐受的作用，因此DCreg完全可以成为减轻自身免疫性疾病与器官移植免疫排斥反应的治疗策略。在小鼠心脏移植前给予供者来源凋亡白细胞而不采用免疫抑制剂的情况下，能显著延长移植心脏的存活时间，并且能抑制同种异体特异性转基因CD4+T细胞激活、增殖进而被清除[18]。在体内稳态下，以DCs作为靶向目标输注供者来源凋亡白细胞，可能能在活体内选择性产生调节性DCs而作为移植中的一种细胞治疗方案，但必须获取供者白细胞并在机体稳态下于移植前几天注入，该方案在活体器官移植中是可以应用的。在角膜移植耐受中利用imDCs能表达抑制T细胞生长或诱导T细胞凋亡的分子(如NO，FasL等)，可诱导移植物高表达FasL形成免疫耐受而延长移植物的存活期。imDC介导T细胞克隆清除角膜内皮和上皮细胞表面表达Fas，使进入角膜内的活化的T细胞凋亡，而角膜细胞本身免于杀伤。在变异性哮喘的发病过程中，CCR7表达上调可作为一种DC免疫负向调节机制，Runx3(一种抑制CCR7表达的转化因子)缺陷小鼠在缺少外源性刺激情况下可形成哮喘样疾病。研究表明病毒感染的浆细胞DC能产生IL-10-Treg，同时能产生吲哚胺-2，3双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)使色氨酸水平升高，T细胞被清除，浆细胞样DC对T细胞的调节作用已在哮喘小鼠模型中得到证实，浆细胞样DC缺失能导致哮喘症状恶化和产生这些症状的细胞增加[19]。

3.2 DCreg与感染性疾病的关系

在感染性疾病过程中，一些慢性病毒感染持续刺激未成熟DC可导致机体对病原体产生耐受和免疫逃避。感染红细胞的疟原虫能够结合到DCs的清道夫受体CD36阻止LPS诱导的人单核细胞源的DCs的成熟和活化初始T细胞的能力。研究[20]发现，在盲肠结扎穿孔(CLP)所致脓毒症小鼠模型的腹腔或静脉注射经C57BL/6小鼠骨髓细胞诱导分化出的CD11clowCD45RBhighDC进行干预，可迅速控制小鼠脓毒症，降低其死亡率。CD11c+CD11b+DC在炎性肠病中能产生IL-23，IL-23在结肠炎症小鼠模型中的肠道炎症中起主导作用。成熟DC产生的活性氧能导致结肠黏膜的损伤、炎症及上皮细胞通透性增加，补充活化的DC至固有层可以加重局部的炎症反应。COPD患者中吸烟者与不吸烟者气道DC数目没有差异，却比正常人气道中的DC明显增多，可以认为COPD患者气道DC数目升高可能与肺部感染对DC在肺部的迁徙有一定影响有关。通过DC在正常组织与COPD小鼠或患者肺组织中分布对比，考虑DC可能启动自身免疫系统，参与了COPD的发病过程。

3.3 DCreg与肿瘤

肿瘤微环境中存在着抑制性细胞因子如：血管内皮生长因子、地诺前列酮、TGF-β、粒系、IL-10等，可诱导调节性DCs的生成，抑制DCs的抗原递呈能力和激活T细胞的能力，从而使肿瘤组织产生免疫逃逸。头颈鳞状皮肤癌肿瘤和基质细胞分泌大量VEGF-A，具有淋巴结转移的病人血浆VEGF-A水平高于无淋巴结转移的病人。应用肿瘤上清或VEGF-A孵育DCs，可以上调其表达B7-H1，B7-H1并诱导IL-10的产生，使DCs再分化成未成熟DCs，失去对异源基因T细胞的促增殖作用，同时可以促进T细胞表达CD25、CTLA-4，并分泌TGF-β和IL-10，加快效应T细胞的凋亡[21]。进展期的肿瘤坏死组织分泌大量的IL-10，从进展期黑色素瘤组织分离到的DCs表型分析显示低表达CD86和CD83，而且对异源基因T细胞的增殖活化能力下降。成熟DC比未成熟DC的抗肿瘤免疫功能强，前者能抵抗肿瘤来源的抑制因子IL-10、TGF-β并激活T细胞，被激活的淋巴细胞具有肿瘤抗原特异性细胞毒作用。因此，可以利用体外发育完善的成熟DC激活免疫应答克服肿瘤逃逸，达到根治肿瘤的目标。

3.4 DC与疫苗设计的研究

以DC做为疫苗设计的靶点已经人们的广泛关注。动物肿瘤模型研究中，体外用肿瘤特异性T细胞表位肽致敏的树突状细胞疫苗接种动物后，能产生保护性的抗肿瘤T细胞介导的免疫，并可使肿瘤消退。大量的动物实验资料显示：树突状细胞肿瘤疫苗对脑胶质瘤有显著疗效，Saskia等在已患有C3脑胶质瘤的小鼠注入树突状细胞肿瘤疫苗，67%的小鼠都获得长期生存(90 d)，而对照组不超过41 d。研究结果表明，脑组织中的一些细胞如小胶质细胞、星形细胞等，在某些条件下可转化为树突状细胞，并发挥树突状细胞的功能。研究结果还显示由肿瘤细胞或肿瘤提取物、多肽等致敏的树突状细胞,回输体内之后，可引起体内肿瘤的消退，这种方法不需进行寻找和分离特异性抗原，致敏的效率较高，方法也较简单，易于操作。经HBsAg冲击树突状细胞制备的HBsAg-DC疫苗，明显促进反映DC成熟程度的表面共刺激分子CD40、CD80的表达，在异体T淋巴细胞增殖反应中能够诱导出很强的增殖应答反应，大大降低了乙肝肝移植术后HBV的再感染率。

4 展 望

DC作为最强大的抗原提呈细胞在免疫应答中具有诱导免疫耐受与负向调节免疫反应的双重作用，随着其机制的研究在不断深入，临床应用也日趋广泛。调节性DC作为DC的一种新亚群，与调节性T细胞的相互作用也引起了极大的关注，它们的免疫调节效应都是由多种膜功能分子和分泌不同细胞因子的功能亚群共同担负，其功能亚群的紊乱可能与多种疾病的发生有关。经不同诱导条件体外可获得相应的亚群细胞，这些亚群细胞具有潜在的临床应用前景。目前，对于体内调节性DCs这一异质性群体来源和功能上的多样性有了越来越多的发现，而且体外诱导调节性DCs生成的新方法不断被建立，这些都提示调节性DCs在免疫反应中具有重要作用。调节性DCs因为在一些病原微生物持久感染以及肿瘤逃避免疫监视等病理过程中发挥不利的作用，以及对于自身免疫性疾病和器官移植耐受可能的治疗价值，使得对于调节性DCs的研究具有重要的现实临床意义。

[1] LiH, Zhang GX, Chen Y, et al. CD11c+CD11b+dendritic cells play an important role in intravenous tolerance and the suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immuno, 2008, 181(4): 2483-2493.

[2] SatoK, Yamashita N, Baba M, et al. Regulatory dendritic cells protectmice from murine acute graft-versus-hostdisease and leukemia relapse[J]. Imminity, 2003, 18(3): 367-379.

[3] Zhang M,Tang H,Guo Z, et al.Splenic stroma drivesmature dendritic cells to differentiate into regulatory dendritic cells [J]. NatIm-munol, 2004, 5(11): 1124-1133.

[4] Xia S, Guo ZH, Xu XF, et al. Hepatic microenvironment programs hematopoietic progenitor differentiation into regulatory dendritic cells maintaining liver tolerance[J]. Blood, 2008, 112(8): 3175 -318.

[5] Wong K, Rodriguez A. Plasmodium infection and endotoxic shock induce the expansion of regulatory dendritic cells[J].J Immunol, 2008, 180(2): 716-726.

[6] Hackstein H, Thomson AW. Dendritic cells: energing pharmacological targets of immunosuppressive drugs [J]. Nat Rev Immuno, 2004, 4(1): 24-34.

[7] Chang CC, Ciubotariu R, Manavalan JS. Tolerization of dendritic cells byT(S) cells the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4 [J]. Nat Immunol,2002, 3(3): 237-243.

[8] Xiao BG, Wu XC, Yang JS. Therapeutic potential of IFN-γ modified dendritic cells in acute and chronic experimental allergic encephalomyelitis [J]. Int Immunol， 2004, 16(2): 13-22.

[9] Bonham CA, Peng L, Liang X, et al. Marked prolongation of cardiac allograft survival by dendritic cells genetically engineered with NFkappa B oligodeoxyribonucleotide decoys and adenoviral vectors encodingCTLA-Ig[J]. J Immunol, 2002, 169(6): 3382-3391.

[10] Chorny A, Gonzalez-Rey E, Fernandez-Martin A, et al. Vasoactive intestinal peptide induces regulatory dendritic cells that prevent acute graft-versus-host disease while maintaining the raft-versus-tumor response[J]. Blood, 2006, 107(9): 3787-3794.

[11] Qian C, An H，Yu Y, et al. TLR agonists induce regulatory dendritic cells to recruit Th1 cells via preferential IP-10 secretion and inhibit Th1 proliferation[J]. Blood, 2007, 109(8): 3308-3315.

[12] Moore KW, De Waal Malefyt R, Coffman RL, et al. Interleukin-10 and the interleukin-10 reeeptor[J]. Annu Rev Immnol, 2001, 19: 683-765.

[13] Sistiama A, Maria N， Pieeinini G, et al. Thymic dendritic cells express indueiblenitric oxide synthase and generatenitric oxidein response to self and alloantigens[J].J Immunol，2000, 164: 4649-4658.

[14] LiN J, Pu XT, Chen GD. Immunoregulatory effects of indoleamine 2,3-dioxygenase in transplantation[J]. Transplant Immunol, 2009, 21(1): 18-22.

[15] Fogel-Petrovic M, Long JA, Knight DA, et al. Activated human dendritic cells express inducible cyclo-oxygenase and synthesize prostagland in E2 but not prostagland in D2[J]. Immunol Cell Biol, 2004, 82(1): 47-54.

[16] Moseman EA, Liang X, Dawson AJ, et al. Human plasmacytoid dendrictic cells activated by CpG oligodeoxynucleotides induce the generation of CD4+CD25+regulatory T cells[J].J Immunol, 2004, 173(7): 4433-4436.

[17] Ferguson TA，Hemdon J，Elzey B, et al. Uptake of apoptotic antigen-coupled cells by lymphoid dendritic cells and cross-priming of CD8(+)T cells produce active immune unresponsiveness[J]. J Immunol, 2002, 168(11): 5589-5595.

[18] HeerH J,Hammad H, Soullie T, et al. Essential role of lung plasmacytoid dendritic cells in preventing asthmatic reactions to harmless inhaled antigen[J]. Exp Med, 2004, 200(1): 89-98.

[19] Fujita S, Seino K, Sato K. Regulatory dendritic cells act as regulators of acute lethal systemic inflammatory response [J]. Blood, 2006, 107(9): 3656-3664.

[20] Bekered jian-Ding I, Schafer M, Hartmann E, et al. Tumour-derived prostag land in E and transforming growth factor-beta synergize to inhibit plasmacytoid dendritic cell-derived interferon-alpha[J]. Immunology, 2009, 128(3): 439-450.

[21] Santegoets SJ，Vonden Eertwegh AJ，Van de loosdrecht AA, et al. Human dendritic cell line models for DC differentiation and clinical DC vaccination studies[J]. Leukoc Biol, 2008, 84(6): 1364-1373.