MicroRNA在白血病中作用的研究进展

韩若乔， 高 艾， (首都医科大学公共卫生与家庭医学学院， 北京 00069;北京市临床流行病学重点实验室;通讯作者，E-mail:gaoai48@ccmu.edu.cn.)

microRNA(miRNA)，是一种21－25 nt长的单链小分子非编码RNA［1］。它广泛存在于真核生物中，可通过碱基配对的方式结合到靶mRNA的3'非翻译区(3'UTR)，从而降解靶mRNA或抑制其翻译，但不影响其转录［2］。miRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达，参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化［3］。越来越多的研究显示，miRNA在白血病中起着癌基因和抑癌基因的作用。本文对miRNA在人类白血病发生中作用的研究进展进行综述。

1 miRNA与白血病的关系

1.1 miRNA具有抑癌基因的功能

1.1.1 miR-15和 miR-16 第一个有关 miRNA与癌症的报道，是Calin等［4］发现成人慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，B-CLL)患者的染色体13q14.3一个30 kb的区域内常伴有两个miRNA基因miR-15和miR-16的缺失或下调。之后，Cimmino等［5］又发现，在 B-CLL细胞中 miR-15a和miR-16a的表达与Bcl-2蛋白表达呈负相关，实验证明它们直接与bcl-2 mRNA的3'端UTR序列相互作用调控Bcl-2蛋白的表达。Bcl-2蛋白是一种通过作用于线粒体来抑制细胞凋亡的蛋白，能够使肿瘤细胞逃避细胞凋亡。因此推测，miR-15a和miR-16a对bcl-2的抑制诱导了白血病细胞的凋亡，从而发挥了类似抑癌基因的作用［6］。

1.1.2 miR-29 b和 miR-181 b T细胞白血病 －1(TCL1)基因也是一个原癌基因，位于染色体14q32.1处，该基因可以作为Akt癌蛋白的辅激活因子增强Akt激酶(也称蛋白激酶B，PKB)的活性，而Akt癌蛋白则是T细胞和B细胞抗凋亡信号传导中一个重要的分子［7］。TCL1在T细胞白血病和淋巴瘤中常发生重排，而且过表达的TCL1可能参与了CLL的形成［8］。研究表明在CLL中 miR-29b和miR-181b因调控癌基因TCL1而表现出其抑癌基因的特性［9］。

1.1.3 miR-221 和 miR-222 miR-221、miR-222 的靶基因是原癌基因c-kit。Nadia等［10］指出miR-221和miR-222的致癌机制可能是与miR-221、miR-222结合的kit的3'端UTR结合区域关键部位出现单核苷酸多态性(3169 G→A)，从而导致kit转录下降和Kit蛋白水平低下，抑制正常红细胞生成及红白血病细胞的增殖，引起急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)的发生，起到了抑癌基因的作用［11］。

1.2 miRNA具有癌基因的功能

1.2.1 miR-155 人类BIC基因是已知的癌基因之一，在BIC基因上具有一段138个核苷酸的保守序列，即编码miR-155的发夹结构。转录因子PU.1 mRNA是B细胞的分化过程中所必需的，其可能是miR-155的靶基因［12］，哺乳动物细胞中发现 PU.1 mRNA的3'端非编码区(3'UTR)存在类似miR-155的靶序列。miR-155另一个可能的靶基因是ICOSL［13］，ICOSL在 T细胞活化、增殖中发挥重要作用，其缺乏可能会影响机体的免疫反应［14］。miR-155水平在儿童Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤及弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)等肿瘤中均有提高。miR-155也与Myc在B细胞中的高表达有关，Myc是一个通过调控细胞增殖和死亡，从而调控细胞生长的转录因子［15］。因此，miR-155可能是作为一个癌基因和Myc协同作用，而其正常功能是在 B细胞的分化中起作用［16］。

1.2.2 miR-17－92簇 MiR-17－92簇由 7种miRNA(miR-17 －5p、miR-17 －3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b－1和 miR-92－1)组成，位于13q31.3的 Cl3orf25 的内含子。He等［17］比较了正常组织和B细胞淋巴瘤样本，发现从miR-17－92位点衍生出来的前体和成熟miRNA在癌细胞中大量增加，miRNA作为癌基因调节肿瘤的形成。在随后的实验中发现，miR-17－19b－1具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的能力。通过生物信息学的预测发现，miR-17－92簇中的miR-17－5p和miR-20a成员，以转录因子E2F1为靶目标。E2F1是通过调节与DNA复制、细胞分裂和凋亡相关的基因来调节细胞周期从G1期向S期的转变［18］。Myc可以诱导E2F1和miR-17－92的转录，而miR-17－5p和miR-20a可以抑制E2F1的翻译。在Myc存在的情况下，miR-17－92基因簇中的miRNA限制了E2F1的活性，通过阻断Myc和E2F1的正反馈循环削弱了Myc对于细胞增殖的影响。此时，miR-17－92基因簇所起的作用是抑癌基因的作用，这与He等的发现相反。然而，当E2F1的表达水平超过一阈值，它也可以引起细胞凋亡，在此情况下，miRNA对于E2F1的负调控可能是通过阻断E2F1的诱导凋亡活性，促进Myc介导的细胞增殖，又支持了He等提出的模型［19］。

1.2.3 miR-106－363簇 在小儿和成人初诊急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)中，大约分别有15%和25%患者是T细胞ALL(TALL)，而T-ALL与患者的预后不良有关。Landais等的研究表明，由 miR-106a，miR-18b，miR-20b，miR-19b－2，miR-92－2和miR-363等6个miRNA组成的miR-106－363簇在46%的T细胞白血病中高表达并可能起着原癌基因的作用［20］。

1.2.4 miR-142与miR-21 在侵袭性B细胞白血病(aggressive B-cell leukemia)中，常有t(8;17)号染色体的异位，miR-142基因正好位于这个区域。异位的结果是miR-142基因与截短的c-Myc基因形成融合基因，导致c-Myc在miR-142基因启动子控制下高表达［21］，促使低度恶性的慢性淋巴瘤演变为高度恶性的B细胞性白血病。MiR-21位于染色体脆性区域17q23.2，是一个发现较早且备受关注的miRNA分子，在多种肿瘤中表达异常，miR-21可以通过抑制PTEN表达，激活PI3K/AKT信号通路使白血病K562细胞系产生对道诺霉素的耐受性［22］。道诺霉素是一种用于白血病治疗的蒽环霉素化疗制剂。产生耐药性是肿瘤化疗的一大障碍，从分子水平上认识耐药性产生的机制有助于探索出更好的治疗肿瘤的方法。

2 miRNA的相关研究方法

检测miRNA最常用和直接的方法是Northern杂交、基因芯片技术、定量PCR、荧光素报告分析(luciferase reporter assay)和MiRNAs靶基因预测技术。Northern印迹是经典的探针杂交检测法，从miRNAs发现到现在，它一直被用于miRNAs的定性研究，若结合使用miRNAs标记(miRNAs marker)也可用于miRNAs的半定量分析。miRNA基因芯片技术具有高通量的优点，是一种理想的快速检测miRNA表达图谱的方法。定量PCR(quantitative PCR，qPCR)是对miRNAs进行定量研究的方法，故与前两种miRNAs检测方法相比，灵敏度明显提高。但是因为成熟miRNAs分子很短、且没有poly(A)尾巴，无法按常规方法设计随机引物进行反转录和PCR扩增，所以通常先用poly(A)聚合酶直接使miRNAs的3'端加上一段 poly(A)尾巴，然后进行PCR扩增。荧光素报告分析不同于以上三种方法，它主要用于检测miRNAs与靶基因相互作用的机制，一般用于已知 mRNA 3'-UTR确实存在相应miRNAs潜在结合位点的情况。基本方法是将荧光素酶分别连于mRNA 3'-UTR片段和突变3'-UTR片段下游，然后导入相应miRNAs，通过检测荧光信号强弱鉴别miRNAs是否通过与mRNA 3'-UTR结合来发挥作用［23］。MiRNAs靶基因预测可以用于寻找未知的miRNAs结合位点。因为miRNA与mRNA的相互作用是一个十分复杂的网络，一种miRNA可以作用于多种mRNAs，一种mRNA又同时受多种miRNAs协同调控，所以目前已知的miRNA-mRNA模块不能涵盖所有可能的结合情况，而miRNAs靶基因预测技术可以通过对可能存在相互作用的miRNAs和mRNAs进行微阵列表达分析，发现miRNAs新的靶位，从而扩充miRNA-mRNA模块，故有广泛的应用价值［24］。

3 miRNA与疾病的诊断和治疗

miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式，这为肿瘤基因诊断开拓了一条新思路。通过对人不同癌组织中miRNA表达谱与正常组织表达谱的对比分析，发现各种肿瘤各自特定的miRNA表达水平均发生了变化。Calin等［25］采用基因芯片分析慢性B细胞淋巴瘤与正常B细胞中miRNA表达谱的差异，该定量分析技术可作为慢性B细胞淋巴瘤有效的新型诊断方法。

肿瘤的发生可能由两方面因素引起:一方面，可能由于某些特定的miRNA低表达或不表达，因此可采用基因治疗的方法，导入相应的外源miRNA;另一方面，可能由于某些特定的miRNA高表达，因此可采用多种方法下调或抑制相应miRNA的表达。如果miRNA作为癌基因发挥功能，则可以设计与miRNA互补的反义寡核苷酸(AMOs)，使其与miRNA结合，通过竞争性抑制miRNA与靶mRNA的结合，而抑制miRNA的功能，降低miRNA过表达所带来的负面效应［26］。如果miRNA作为抑癌基因发挥功能，则可以加入人造miRNA以抵制不足和抑制恶性肿瘤的生长。利用病毒或者脂质体的表达系统可以瞬时引入大量miRNA。这些技术可以保证在某些组织特异性的启动子控制之下，表达pre-miRNA及其两侧序列，并且刺激内源性的miRNA加工，产生正确的miRNA，抑制特定基因表达。然而这一方法仅在细胞培养中有所尝试，仍需要进一步在动物模型中检测［27］。

虽然目前miRNA在多种癌症中的研究已经取得了一些成果，但其参与白血病的致病机制并没有完全了解，这些问题仍然需要更加深入地研究。

［1］ Lim LP，Glasner ME，Yekta S，et al.Vertebrate microRNA genes［J］.Science，2003，299(5612):1540.

［2］ David PB.MicroRNAs:Target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136(2):215 －233.

［3］ Sandhu SK，Croce CM，Garzon R.Micro-RNA expression and function in lymphomas［J］.Adv Hematol，2011，2011:347137.

［4］ Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(24):15524 －15529.

［5］ Cimmino A，Calin GA，Fabbri M，et al.MiR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(39):13944 －13949.

［6］ 张艳，徐广贤，贾浩，等.microRNA对肿瘤细胞增殖与分化的调控［J］.科技导报，2009，2(2):94 －98.

［7］ Pekarsky Y，Koval A，Hallas C，et al.Tcl1 enhances Akt kinase activity and mediates its nuclear translocation［J］.PNAS，2000，97(7):3028–3033.

［8］ Bichi R，Shinton SA，Martin ES，et al.Human chronic lymphocytic leukemia modeled in mouse by targeted TCL1 expression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(10):6955 －6960.

［9］ 杨桂花，王芳，张俊武.MicroRNAs在血液细胞分化及相关肿瘤中的作用［J］.中国医学科学院学报，2007，29(3):425－429.

［10］ Nadia F，Laura F，Elvira P，et al.MicroRNAs 221 and 222 inhibit normal erythropoiesis and erythroleukemic cell growth via kit receptor down-modulation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(50):18081－18086.

［11］ He H，Jazdzewski K，Li W，et al.The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma［J］.PNAS，2005，102(52):19075 －19080.

［12］ John B，Enright AJ，Aravin A，et al.Human microRNA targets［J］.PLoS Biol，2004，2(11):1862 － 1879.

［13］ Pfeffer S，Zavolan M，Grasser FA，et al.Identification of virus-encoded microRNAs［J］.Science，2004，304(5671):734 － 736.

［14］ 徐卫，李建勇.MicroRNA与淋巴增殖性疾病［J］.国际病理科学与临床杂志，2007，27(1):1 －5.

［15］ Pelengaris S，Khan M，Evan GI.Suppression of Myc-induced apoptosis in β cells exposes multiple oncogenic properties of myc and triggers carcinogenic progression［J］.Cell，2002，109:321 －334.

［16］ Els PS，Tam W，Sun L，et al.Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas［J］.PNAS，2005，102(10):3627－3632.

［17］ He L，Thomson JM，Hemann MT，et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene［J］.Nature，2005，435:828 －833.

［18］ Trimarchi JM，Lees JA.Sibling rivalry in the E2F family［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(1):11 －20.

［19］ O’Donnell KA，Wentzel EA，Zeller KI，et al.C-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression［J］.Nature，2005，435:839－843.

［20］ Landais S，Landry S，Legault P，et al.Oncogenic potential of the miR-106－363 cluster and its implication in human T-cell leukemia［J］.Cancer Res，2007，67(12):5699 －5707.

［21］ Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A，et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse［J］.Curr Biol，2002，12(9):735－739.

［22］ Bai H，Xu R，Cao Z，Wei D，et al.Involvement of miR-21 in resistance to daunorubicin by regulating PTEN expression in the leukaemia K562 cell line［J］.FEBS Lett，2011，585(2):402 －408.

［23］ Jindra PT，Bagley J，Godwin JG，et al.Costimulation-dependent expression of microRNA-214 increases the ability of T cells to proliferate by targeting Pten［J］.J Immunol，2010，185(2):990－997.

［24］ Jayaswal V，Lutherborrow M，Ma DDF，et al.Identification of microRNA-mRNA modules using microarray data［J］.BMC Genomics，2011，12:138.

［25］ Calin GA，Liu CG，Sevignani C，et al.MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias［J］.PNAS，2004，101(32):11755 －11760.

［26］ Weiler J，Hunziker J，Hall J.Anti-miRNA oligonucleotides(AMOs):ammunition to target miRNAs implicated in human disease?［J］.Gene Ther，2006，13(6):496 －502.

［27］ Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.RAS is regulated by the let-7 MicroRNA family［J］.Cell，2005，120:635 － 647.