神经导向因子Netrin-1及其受体的作用研究现状＊

柯先金,李倩,丁新生#

1.南京医科大学第一附属医院神经内科,南京210029;2.南京医科大学附属南京第一医院内分泌科,南京210006

神经系统的正确形成有赖于神经导向因子的参与引导。轴突的生长锥可探测周围环境中的神经导向因子,通过吸引与排斥的方式使形成的轴突正确到达靶向部位。目前研究发现的神经导向因子主要包括 ：Netrins、Slit、Ephrin 和 Semaphorins共 4 个家族[1],其中Netrins家族是最早在神经系统中发现的可溶性神经导向因子,近年来研究发现Netrins家族及其受体在非神经组织中广泛表达并发挥着重要的作用。本文着重对Netrin-1及其受体的作用进行综述。

1 Netrin-1的结构及其作用

1.1 Netrin-1的结构及表达部位 Netrins家族是在结构上种属间高度保守的细胞分泌型可溶性蛋白,其命名源于梵语“netr”,意为“引路者”。其经典成员主要包括：UNC6(线虫)、Netrin-A 及B(果蝇)、Netrin-1～4(哺乳动物),Netrin-G1及 G2[2]。所有Netrin蛋白均包含6个可识别的结构域,从N端到C端依次为：信号肽SP(signal peptide);与层粘连蛋白Ⅵ结构相似的结构域Lam NT(laminin N-terminal domain);与层粘连蛋白Ⅴ结构域相似的3个表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)重复(Lam EGF repeat);肝素结合的羧基端Netrin CT(Netrin C-terminal domain),此种蛋白在种属间最为可变[3]。Netrin-1是对突变线虫

缺陷unc-6基因进行基因分析而被发现,并命名为轴突导向因子(axon guidance factor),现称神经导向因子(neural guidance factor)。Netrins分子量约 70～80 kD,在发育中的脊髓底板、脑室腹侧区大量表达[4],Tessier-Lavigne等[1]发现其可刺激生长中的脊髓联合神经元生长和定位。体内多个部位均可表达Netrin-1,如神经系统中的底板、脊髓腹侧的神经胶质细胞、侧脑室腹侧、内囊、小脑皮质等;非神经系统组织中的乳腺腺泡、胰腺、动脉的背侧、心肌肌细胞及卵巢等。

1.2 Netrin-1的作用

1.2.1 在神经系统发育和修复中的作用 Netrin-1在胚胎神经发育中调控轴突生长,定向细胞迁移在成年中枢神经损害后发挥抗凋亡、诱导细胞迁移、调节轴突方向形成等作用。在脊椎动物的发育过程中,Netrin-1从神经管引导神经上皮细胞和轴突沿背侧和腹侧方向延伸,促使上下级神经元及轴突与靶器官之间形成正确联系[5]。在中枢神经系统发育过程中,Netrin-1根据所结合受体的不同,对轴突起吸引或排斥作用,如与结肠癌缺失蛋白(deleted in colorectal carcinoma,DCC)受体结合发挥吸引作用,单独与 UNC5同源蛋白(UNC5 homolog,UNC5H)受体结合起短时程的排斥作用,DCC受体与UNC5B受体共同作用,起长时程排斥作用。Serafin等[6]通过基因缺陷小鼠证实缺乏Netrin-1可导致胼胝体、前连合、海马连合等不能形成;在胚胎发育期的神经元、少突胶质细胞、中胚层细胞迁移中,Netrin-1也发挥重要作用。Furne等[4]研究发现,Netrin-1不仅对脊髓联合神经元有吸引作用,还能抑制其凋亡。在脊椎动物外周神经发育过程中,Netrin-1可使滑车神经轴突远离中线生长,对背根神经节神经元也起着排斥作用。Masuda等[8]发现Netrin-1突变的小鼠背根神经节不能正确形成,外源性补充Netrin-1能得以纠正。

Netrin-1对神经损伤具有一定的修复作用。Moon等[9]对自身免疫性神经炎大鼠模型的研究显示,在免疫损伤后周围神经中Netrin-1的表达显著增高,主要存在于Schwann细胞中,可促进神经元存活、神经纤维建立正确的联系及促进髓鞘修复。动物实验发现,脑梗死后Netrin-1受体UNC5H在梗死灶局部广泛表达,UNC5H已被证实可诱导p53途径的细胞凋亡[10],提示UNC5H参与脑梗死后的神经元损伤。向梗死灶内持续注入Netrin-1可降低p53的表达,减缓缺血所致的神经元凋亡,提示Netrin-1能通过抑制p53途径抗凋亡。但Petit等[11]发现Netrin-1排斥神经元细胞向脊髓损伤坏死区迁移,抑制脊髓损伤的恢复,下调Netrin-1的表达可能对脊髓损伤的恢复有利。

1.2.2 在血管系统中的作用 神经系统与脉管系统结构相近,神经元和血管在生长方式上也表现出惊人的相似性。与生长锥类似,生长中的血管丛前沿也具有一个运动型结构-端细胞(tip cell)。端细胞通过延伸出的大量丝状伪足探测细胞外基质中的导向信号,使芽生的毛细血管顺血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的浓度梯度生长。相邻内皮的端细胞融合形成管腔,产生新的血管分支[12]。这种长方式上的相似性,提示它们之间可能是通过某种物质联系起来。现已知参与神经轴突导向的4对主要的配体及其受体在血管形态发生中也起着一定的导向作用,Netrin-1及其受体就是其中之一。

Netrin-1对血管的形成既有正向作用又有负向作用,具体机制还不明确。Park等[13]通过细胞培养比较 Netrin-1、VEGF及血小板源性生长因子(platelet derived grow th factor,PDGF)对内皮细胞的作用,结果显示Netrin-1也具有促进内皮细胞增殖、迁移和粘附的作用,还能增强VEGF的作用。Netrin-1与VEGF促进血管新生的作用不同,Fan等[14]研究表明,Netrin-1不仅能促进微血管形成,还能促进动脉血管生成,而VEGF只能促进毛细血管的生成,不能改变血管结构。Wilson等[15]通过抑制斑马鱼的Netrin 1a mRNA的表达,抑制血管发生,表明Netrin-1在脊椎动物发育过程中对促进血管生成起着一定的作用,但在内皮细胞上未找到Netrin-1相关受体。Nguyen等[16]报道Netrin-1与其受体DCC结合,可增加一氧化氮的含量,诱导血管生成。在人体内的研究也发现Netrin-1具有促进血管生长的作用。杨昀等[17]检测正常妊娠妇女和子痫前期妊娠妇女的胎盘组织中的Netrin-1 mRNA和蛋白的表达及胎盘组织中的血管密度,结果显示子痫前期妊娠妇女胎盘组织中Netrin-1表达下降,且胎盘血管密度降低。但也有研究得到与之截然相反的结果,Lu等[18]证实Netrin-1与其受体UNC5B结合能导致内皮细胞的伪足收缩,并且通过突变的UNC5B基因小鼠、突变 UNC5B和Netrin-1基因的斑马鱼发现内皮端细胞的伪足异常伸展,产生过多的小管分支和非正常的迁移。得出这2种不同的结论是何种原因呢?Yang等[19]通过原代培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),用 RT-PCR检测其上Netrin-1的各种受体表达;用体外实验分别检测Netrin-1对H UVEC的增殖、迁移和管状结构形成的作用;用兔角膜新生血管实验研究在不同浓度Netrin-1作用下,体内血管新生的情况;结果显示,H UVEC上有UNC5B受体表达,在浓度＜500 ng/mL时均表现为促进血管新生作用,而在(1000～5000)ng/mL时表现为抑制血管新生作用。提示Netrin-1对血管新生在低浓度时为促进作用,高浓度时为抑制作用。Fan等[14]研究得出相似的结论,人大脑内皮细胞和人主动脉平滑肌细胞的迁移和小管形成实验中,不同浓度Netrin-1,作用不同。

1.2.3 与肿瘤发生的关系 Meyerhardt等[20]研究发现人类大约50%的脑肿瘤和神经母细胞瘤Netrin-1表达量下降或缺乏。Latil等[21]研究发现前列腺癌中 Netrin-1的表达量下降。但 Mazelin等[22]报道小鼠小肠段Netrin-1过多表达会出现自发性增生肥大甚至发展为腺癌。Fodde等[23]报道携带突变的腺瘤结肠息肉基因小鼠过多表达Netrin-1会增加腺癌的发生率。这可能与Netrin-1与其受体DCC和UNC5H结合,使DCC和 UNC5H促进凋亡作用受到抑制有关。Delloye-Bourgeois等[24]发现神经母细胞瘤患者中自分泌的Netrin-1促进肿瘤的生长,其原因可能是 Netrin-1与UNC5H结合,阻断UNC5H的促凋亡作用;该研究小组还通过体外实验和小鼠模型证实,抑制Netrin-1的表达可促使神经母细胞瘤凋亡并抑制其转移。Roperch等[25]发现 Netrin-1通过与凋亡前蛋白TAp73A作用诱导人颈部肿瘤细胞凋亡。

2 Netrin-1的受体

2.1 UNC5H 因unc5h基因与线虫的unc5基因同源,因此得名,是经典的依赖受体,在人类中有4个成员 ：UNC5A 、UNC5B、UNC5C 及 UNC5D,在啮齿动物中称 UNC5H1、UNC5H2、UNC5H3及UNC5H4。UNC5H的胞外含有2个免疫球蛋白结构域Ig和2个血小板反应蛋白结构域(thrombospondin type 1,TSP-1),胞内依次为ZU-5(ho-mologous to aportion of Zona Occludens 21),DB(DCC binding domain)、DD(death domain)。DD结构域通常存在于死亡受体家族C端。啮齿动物UNC5H的4种同源物都能与Netrin-1结合,结合部位是Netrin-1的 Laminin结构域与 UNC5H的免疫球蛋白结构域。对线虫的研究显示,UNC5H传递Netrins的排斥性作用,即介导轴突远离Netrins生长。UNC5H胞内区能独自起特异性排斥作用,而由 Netrin-1促发的 UNC5H(DB段)和DCC(P1区)蛋白胞内区结合后,本由DCC介导的吸引作用转为排斥作用。Finger等[26]研究显示UNC5H3参与小脑颗粒细胞和浦肯野细胞迁移及皮质脊髓束的轴突导向。DD结构域与细胞死亡调节有关,Hong等[27]报道 UNC5H的死亡结构域突变会引起UNC5H的神经突起排斥,野生型的UNC5H1将导致神经元死亡。Llambi等[28]发现过表达的UNC5H1～3能诱导细胞发生凋亡,这一过程可被其配体Netrin-1阻断。UNC5H被caspase-3在胞内区切断,剪切位点突变和死亡结构域缺失将抑制UNC5H诱导的细胞凋亡。在血管发生过程中,UNC5B与Netrin-1结合也具有排斥作用,Carmeliet等[29]研究发现血管内皮端细胞上的UNC5B与Netrin-1结合能介导端细胞的排斥作用。UNC5B能诱导细胞凋亡,Castets等[30]实验研究发现Netrin-1通过阻断UNC5B凋亡前作用和下游死亡信号通路,能抑制血管内皮细胞凋亡。Larrivee等[31]研究发现 UNC5B的激活能抑制血管新生,表明UNC5B是潜在的抑制血管新生的靶目标,可能对抑制肿瘤的生长有一定的意义。Bernet等[32]发现UNC5C突变加剧结肠癌患者肿瘤的恶化,在小鼠中未激活的UNC5C加重肠道肿瘤的发展并抑制癌细胞的凋亡。表明UNC5H不仅介导神经的排斥作用,还是一种抑癌基因。

2.2 DCC 编码Netrin-1受体DCC的基因dcc位于人染色体18q21,在人类结肠癌患者中普遍缺失这种基因,因而得名,是经典的依赖受体。DCC、Neogenin和UNC40组成免疫球蛋白超家族的1个亚群,主要由3个功能区组成,胞外是4个免疫球蛋白和6个Ⅲ型纤维连接蛋白(fibronectin,FN)组成,跨膜区富含疏水性氨基酸,胞内依次为P1、P2、P3结构域。DCC是抑癌基因,结肠肿瘤中常存在DCC缺陷,胃、前列腺、卵巢、食管、血液等多种肿瘤中其表达也存在减少或缺失,体外实验及DCC敲除小鼠在恢复其表达后能抑制肿瘤生长。DCC在脊髓联合神经元轴突生长锥向底板生长时、跨过后及随后生长到腹部索(funiculus)时表达,具有与Netrin-1直接结合的活性,结合位点包括Netrins的Laminin结构域与DCC胞外第5个FN功能域[33],继而引发下游胞内P3区二聚化,传递吸引性信号介导轴突朝向Netrins高浓度区域生长。体外实验中抗DCC抗体能特异阻碍Netrin-1依赖性联合神经元轴突生长。缺乏UNC-40、Frazzled(果蝇)和DCC可导致本应由Netrin-1吸引的轴突生长方向错误。敲除DCC小鼠的表型与缺乏Netrin-1非常类似。这些都支持DCC家族是Netrin-1受体传递神经轴突导向生长作用的关键分子。

2.3 唐氏综合症细胞黏附分子(Down's syndrome cell adhesion molecule,DSCAM) DSCAM是由胞外10个免疫球蛋白和6个重复FNⅢ组成的1种Ⅰ型跨膜受体。因长时间未找到其相应配体,故被认为是1种孤立受体,近年来其被证明是Netrin-1的受体,在发育过程起着轴突吸引导向作用。Netrin-1与其免疫球蛋白部分结合,具体下游激活信号通路尚未阐明[34-37]。

2.4 A2b受体 A2b是腺苷(adenosine)受体,A2b家族有A1、A2A、A2B及A3 4个家族成员[38],是1种7次跨膜蛋白,胞内区羧基端与DCC受体相互作用。A2b受体与Netrin-1的结合必须依赖DCC受体。Corset等[39]证实Netrin-1存在时DCC能与A2b胞内区结合,活化A2b,引起cAMP产生,细胞内信号级联放大,介导轴突吸引作用。但Stein等[40]研究阻断A2b受体,Netrin-1没有任何反应或反而增强轴突传递吸引。在视神经生长锥生长早期,由Netrin-1启动的吸引性导向作用依赖A2b,随着轴突成熟,出现A2b表达下调和依赖A2b的Netrin-1诱导轴突生长作用消失[41]。总之,A2b是Netrin-1的受体,但其是否介导轴突导向作用还有待于进一步研究。

2.5 整合素 α 6β4和 α 3β1 α 6β4 整合素是由 α 6 和β4两个亚单位形成的异二聚体糖蛋白,属于整合素型层粘连蛋白受体,其表达位点主要是在大多数上皮基底层的表面和少数其它类型的细胞上。其结构是整合素中独一无二的,信号转导通过β亚单位实现。整合素 α 6β4和 DCC受体共同与 Netrin-1作用,β亚单位与DCC胞内区羧基端作用产生信号转导,使胰腺上皮细胞增殖和迁移。这种作用在其它组织可能有相同的作用,如乳腺腺泡、肾小管上皮细胞 、肺泡管的形成。 Yebra 等[42]证明 α 6β4 和 α 3β1结合素与Netrin-1的羧基末端结构域结合,调节内皮细胞的迁移,但这种作用在体内还有待于证实。Stanco等[43]表明Netrin-1与α 3β1结合对大脑皮质和海马区的GABA能中间神经元的迁移是必需的。另外,α 3β1对肿瘤的发生发展起着重要的作用。

3 小结与展望

综上所述,神经导向因子Netrin-1早已被证实通过结合不同的受体介导神经轴突的吸引和排斥作用,调节神经的迁移生长。对胚胎时期神经系统的正确形成和神经损伤后的修复起着重要作用。Netrin-1在非神经组织中的作用主要为影响上皮细胞的粘附、迁移、增殖、抗凋亡作用以及促进肿瘤的发生,不同的作用与其结合的不同受体有关。对DCC和 UNC5H 受体研究比较深入 ,A2b、α 3β1 和 α 6β4受体的作用和分子机制还有待进一步阐明。Netrin-1对血管新生的作用是促进还是抑制抑或是起着双重作用,不同学者持有不同的观点,是否与Netrin-1的浓度有关、结合受体的不同有关、还是与外周环境的不同有一定关系有待证实。Netrin-1是否是潜在的癌基因,Netrin-1与其不同受体之间的作用分子机制需进一步研究。

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