固定化脂肪酶研究进展

冯 超，蒋丽娟，黎继烈，郝聚喜

（中南林业科技大学，湖南长沙410004）

固定化脂肪酶研究进展

冯 超，蒋丽娟，黎继烈*，郝聚喜

（中南林业科技大学，湖南长沙410004）

固定化脂肪酶由于其易与底物分离且可重复使用而备受关注。综述了常用的固定化方法，包括物理吸附法、共价交联法和包埋法，不同的固定化方法对酶的性质有不同的影响。

固定化，脂肪酶，载体

1 固定化脂肪酶的方法

1.1 物理吸附法

物理吸附是最简单的固定化方法，利用离子键或吸附作用将酶固定到载体上，操作相对简单，很少用到有机试剂。

高阳［6］等以不同大孔树脂吸附法固定化假丝酵母99-125脂肪酶，在微水有机相中的应用表明，非极性树脂NKA是最佳的固定化载体。结果表明，在给酶量为1.92∶1（初始酶粉与树脂的质量比），pH为7.4，体系水含量为15%（水与油的质量比），反应温度为40℃条件下，固定化酶具有最佳的催化能力。固定化酶连续反应19批以后，生物柴油的转化率仍然保持为 70.2%，固定化酶的酶活为初始值的85.1%，显示出固定化酶具有良好的操作稳定性。

李南薇［7］等从20种不同来源的树脂中筛选出固定化效率高且价格低廉的D4020树脂作为载体，系统研究了固定化条件对固定化效率及固定化酶转酯活力的影响。结果表明，最适加酶量、缓冲液pH和吸附时间分别为0.7g/g、9.4和4h，固定化酶的转酯活力为404.0U/g，而所用的游离酶不能催化该转酯反应。

王冰［8］等以沙蒿多糖-壳聚糖复合磁性微球为载体，采用物理吸附法固定化脂肪酶，对固定化过程中对酶活力有影响的各种因素进行研究，同时对固定化酶的部分理化性质、最适pH、最适温度、酶的热稳定性以及表观米氏常数与游离酶做了比较。实验结果表明：固定化脂肪酶的最佳条件为每0.1g载体加2%（w/v）的酶溶液0.9mL，固定8h，pH8.4，温度为50℃。固定化酶的Km小于游离酶的Km，其最适pH和最适温度分别为8.0和50℃，而且固定化脂肪酶具有良好的热稳定性、可应用性和重复使用性。

纵伟［9］等以磁性壳聚糖微球为载体，用物理吸附法固定化脂肪酶，对影响固定化的各种因素进行考察，确定其最优条件，并比较游离酶和固定化酶的pH和热稳定性，研究固定化酶的使用稳定性，固定化的最适宜条件为采用加酶量600U/g，温度5℃，pH7.0，固定时间2h，固定化酶的pH和热稳定性都优于游离酶，固定化酶连续使用5次，其相对酶活仍为使用前的57.8%，具有较好的操作稳定性。

1.2 共价交联法

共价交联法取决于酶分子与其他物质之间的共价键，通常在载体上加入氨基、醛基等功能性集团来使酶结合得更牢固。使载体活化的方法很多，主要有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等［1］。

刘新喜［10］等用蛋壳作载体固定化脂肪酶，其工艺条件为：酶用量为 0.12g/g，搅拌吸附时间为30min，在pH为6.2、室温下得到的固定化酶的最大活力29.41U/g，该固定化酶最适用的温度为35℃，pH为9.0，重复使用6次后活力仍保留53%。

Neerupma Nawani［11］等将脂肪酶用戊二醛交联到HP-20微球上，得到的固定化酶的最适pH几乎与游离酶相同（pH8.5），而固定化酶的最适温度比游离酶高5℃，交联的酶在80℃时更稳定。

M.G.Carneiro-da-Cunha［12］等将脂肪酶通过活化剂（高碘酸钠或碳二亚胺）固定到由纤维素、纤维素衍生物及纤维素复合材料（纤维素醋酸盐和纤维素酯）薄膜上，获得的最大酶活为17.5!mol/s·m2。

Seong-Ho Choi［13］等在不同的实验条件下将脂肪酶固定到含环氧基的聚（甲基丙烯酸缩水甘油酯）-聚乙烯微球上，固定化酶的活力为160～500U/mg·min，固定化酶活力随环氧基浓度的增加而增加。

罗文［14］等以多孔玻璃珠预处理后，用有机硅烷衍生化后再用戊二醛活化作为载体，采用共价法对假丝酵母99-125脂肪酶进行了固定，对比了固定化酶与游离酶的最适反应温度、pH以及热稳定性。并以所制备的固定化酶为催化剂，在微水体系中利用菜籽油合成生物柴油，考察了溶剂量、体系水含量、甲醇等因素对固定化酶催化性能的影响，研究了固定化酶的操作稳定性。固定化脂肪酶的半衰期在390h以上，此固定化脂肪酶具有良好的操作稳定性。

1.3 包埋法

包埋法是不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法。其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应，将酶固定于载体材料的网格中［15］。包埋法包括凝胶包埋法和微囊化法。

杨本宏［16］等研究了以海藻酸钠为载体，用包埋法制备固定化德氏根霉（Rhizopus delemar）脂肪酶的条件。将酶粉和海藻酸钠溶于pH5.0的HAc-NaAc缓冲溶液，用注射器将此混合液滴入到0.05mol/L无菌CaCl2溶液中，静置固化45min，经过滤、洗涤和干燥后得到球状固定化酶。固定化酶的活力回收约为34.1%。酶学性质研究表明，此固定化酶的热稳定性较好。游离酶在60℃下保温1h已完全丧失活力，而固定化酶在100℃下保温1h仅损失36.2%的活力，在100℃下保温6h仍可保持46.8%的酶活力。酶经固定化后，其橄榄油水解反应的最适温度由40℃上升至90℃，Km值由13.8mg/mL降为8.1mg/mL。常见有机溶剂对固定化酶的活力影响较小。将该固定化脂肪酶用于非水溶剂中正戊酸异戊酯的合成，重复使用6次后，固定化酶仍保持95%的酶活力。

王爱玲［17］等以海藻酸钠明胶为复合载体，采用包埋法制备固定化黑曲霉脂肪酶，考察了海藻酸钠、明胶浓度等因子对固定化效果的影响，比较固定化酶和游离酶对温度、pH等条件的稳定性。结果表明，制备固定化黑曲霉脂肪酶的最优条件为：海藻酸钠、明胶浓度分别为1.25%和0.5%，CaCl2浓度为10%，给酶量为450U/g，固定化酶最适温度为35℃，最适pH为9.0。

1.4 其它方法

黄磊［18］等考察了泡沫陶瓷的孔径分布和表面性质对脂肪酶固定化的影响。泡沫陶瓷用硅烷偶联剂对其进行表面改性处理后，成功地应用于脂肪酶的固定化。研究表明，泡沫陶瓷的纳米孔孔径分布非常适合脂肪酶的固定化，对固定化酶的催化效率有决定性的影响。经1h的固定化，泡沫陶瓷固定化酶的活性达商业化硅藻土固定化酶的1.33倍，体积活力为其2.63倍，蛋白载量为45.36mg/g陶瓷，比活为1215.39U/g，活力回收为41.2%。

曾淑华［19］等利用以四甲氧基硅烷（TMOS）和甲基三甲氧基硅烷（MTMS）为前驱体的溶胶-凝胶法（sol-gel）固定洋葱假单胞菌属脂肪酶，考查了固定化酶和游离酶的酶学性质及催化不同油脂酯交换合成生物柴油的情况。结果表明，80℃以下固定化酶能保持80%以上的酶活，而游离酶在50℃以后活力急剧下降，到80℃残余酶活约为10%；固定化酶在体积分数50%的甲醇中处理48h能保持85%的酶活，在体积分数90%的乙醇中处理48h能保持31%的酶活，而游离酶残余酶活只有69%和0；在酯交换反应中固定化酶的催化效率比游离酶高10%～20%，且固定化酶重复使用11次后仍能保持60%的酶活。结果显示，酶经过固定化后稳定性和催化活性显著提高。

刘勇［20］等研究了吸附-絮凝耦合的方法固定脂肪酶的工艺条件。结果表明：在33℃下，用0.03mol/L的磷酸二氢钾缓冲液控制体系pH为7.0，酶与树脂（质量比1∶8）作用吸附1h后，用0.2mL絮凝剂聚丙烯酰胺（wPAM=0.5%）处理，得到活力较高的固定化脂肪酶。固定化酶最适pH9.0，最适温度为45℃，活力为405U/g，酶活回收率可以达到40%。固定化脂肪酶制备简便，可重复使用，稳定性较高。

Katsuya Kato［21］等通过溶胶-凝胶的方法将脂肪酶固定到无机材料上来合成手性化合物，用乙烯基三乙氧基硅烷制得的溶胶-凝胶脂肪酶在水溶液中有高的水解活性。

Gabriela Kuncová［22］等通过将脂肪酶加入到含有有机-无机的溶胶-凝胶基质的前体溶液中固定到铁酸盐粉末上。固定脂肪酶和铁酸盐粉末的最佳前体溶液的组成是含有功能化的氨基和烷基的硅烷，有机的交联如戊二醛和聚乙烯醇并不会提高其活力和载体的机械强度。

Roila Awang［23］等将脂肪酶固定到先用联合固定剂（包括卵磷脂、胶质、聚乙烯、乙二醇、氯化镁）浸湿的以棕榈为基质的聚亚胺酯泡沫上，固定化酶的活力通过在己烷中的油酸或油醇的转酯反应测得。天然酶和固定化酶的最适温度均为40℃，说明固定化并没有改变脂肪酶的一般性质，该固定化酶至少可以重复使用四次。

李丽丽［24］等以米糠为原料，研究了米糠固定化脂肪酶的制备及生化性质。结果表明：米糠经过一定的处理后，不仅能获得米糠中油脂，且能保留米糠脂肪酶的活性，形成一种以米糠为天然载体的米糠固定化脂肪酶（immobilized rice-bran lipase，IRB-L），且以石油醚在35℃下去脂5min得到的IRB-L的活动度最高，约为10.72mL/g。该酶在催化油脂水解反应中，最适水解温度约为40℃，最适pH为7.0。在催化油脂酯化反应中，最优条件为IRB-L与油酸的质量比为60%，甲醇与油酸摩尔比1∶1，反应温度40℃，反应时间6h；在上述条件下，产物油酸甲酯得率可达44.98%。且该酶在40℃的环境中保存40d可维持80%以上的活性，在批次水解反应下重复使用5次之后，残余酶活力仍达62%。

2 存在的问题与展望

2.1 存在的问题

很多固定化方法在单独使用的时候往往有其缺点所在，吸附法中由于酶与载体之间的作用力弱，改变温度、pH、离子强度等条件，酶就可能从载体上解离下来。吸附法的另一个缺点是其他物质也可能非特异性吸附到载体上，这就可能改变固定化酶的性质并影响酶的吸附量。共价交联法过程较复杂，化学试剂的使用使酶在处理过程中易失活，有机溶剂和金属离子对酶的活性会有一定的影响。包埋固定化酶易流失。另外，纳米级材料的应用中，载体的机械性和操作过程中载体的损失等问题也有待解决。在实际的应用过程中常将几种方法联用。

2.2 展望

脂肪酶在食品、洗涤剂、制药等方面应用广泛。由于固定化酶的制备方法过于复杂，效率低、成本高，以及化学试剂的使用易使酶活力降低或失活等因素的制约，固定化酶在工业生产中的应用受到限制。寻找廉价、易于活化和制备的载体是脂肪酶固定化发展的一个方向。另外，由于酶的活性与其所处的微环境有关，改善其反应的微环境可能会提高其活力。但随着生物技术以及材料、化工等各相关学科的发展，新型载体的开发利用及各种固定方法的发展完善，相信固定化脂肪酶的工作会有新的突破。

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Research progress in lipase immobilization

FENG Chao，JIANG Li-juan，LI Ji-lie*，HAO Ju-xi
（Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

Immobilized lipase became a hotspot because its easy to separate and can be reused.The common immobilization methods were generally introduced including physical adsorption，covalent cross-linking method and entrapment method.Different immobilization methods had different effects on the enzyme.

immobilization；lipase；carrier

TS201.2+3

A

1002-0306（2011）02-0373-04

脂肪酶（Lipase EC3.1.1.3，甘油酯水解酶）是一类特殊的酰基水解酶，它的底物是油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键［1］；脂肪酶能在油-水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前被重点研究的酶催化剂［2］。脂肪酶与底物的作用过程包括：第一步，活化丝氨酸的酰基化（通过亲核攻击）和酯键裂解，甘油二酯释放后，四面体半缩醛中间产物形成；第二步，脱酰基作用（丝氨酸酰基化的逆反应），是活化水分子对酯进行攻击，接下来的裂解过程同样包括脂肪酸释放后四面体半缩醛中间产物结构的形成［3］。游离脂肪酶催化技术虽然成熟，但酶分离困难，不能重复使用，难以实现过程连续化，因此脂肪酶催化技术工业化很大程度上取决于酶的固定化［4］。当底物和产物是小分子的可溶性物质时，固定化酶更占优势。所谓固定化酶就是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶。固定化酶的两个最大的优点是酶易与产物分离，可重复使用。通过固定化操作，可以改变酶的一些性质，例如Michiaki Matsumoto等［5］将脂肪酶固定到海藻酸钠凝胶、硅酸钠微囊及大孔树脂上来研究其耐热性，在60℃时，固定在海藻酸钠凝胶中的固定化酶有更好的稳定性，而在60℃以上时，微囊固定的酶更稳定。说明固定化的不同方法以及载体与酶之间的结合能力对酶的性质有些影响。本文综述了固定化脂肪酶的研究现状及存在的问题，以期为脂肪酶的研究提供新的思路。

2010-02-26 *通讯联系人

冯超（1985-），女，硕士研究生，主要从事生物新能源的研究。

国家科技支撑计划（2007BAD41B06）。