血必净对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠肺组织高迁移率族蛋白1表达的影响

张之龄，尹小燕，童小文，朱健

(上海交通大学医学院附属第九人民医院急诊科，上海200011)

脓毒症是临床上常见的急危重症之一，为严重感染引起的不可控制的全身性炎性反应，可迅速发展为脓毒性休克和多器官功能障碍综合征(MODS)。肺脏是这一连贯病理过程中最早也最易受累的靶器官，临床表现为急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征［1］(ALI/ARDS)。虽然ALI的具体发病机制仍不明确，但研究［2］发现高迁移率族蛋白 1(HMGB1)可能作为新的“晚期”炎症因子参与了内毒素的致病过程，对ALI/ARDS的发生和发展起重要作用。本实验在建立大鼠LPS诱导脓毒症肺损伤模型的基础上，观察肺组织HMGB1的表达，并采用血必净干预，研究其对大鼠脓毒症肺损伤的保护作用，探讨可能的作用机制，为防治脓毒症肺损伤开辟新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠45只，2.5～3.5 月龄，体质量 250 ～280 g/只，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供［生产许可证号:SCXK(沪)2008-0016］。

1.2 实验药品和试剂 脂多糖(LPS，Escherichia coliO127:B8，L3129，Sigma，美国);HMGB1 羊抗多克隆抗体(Santa Cruz，美国);血必净注射液(规格10ml/支，天津红日药业有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组、模型建立及给药方法 以10%水合氯醛5m l/kg腹腔注射将大鼠麻醉后固定，经大鼠股静脉按5 mg/kg注射LPS。45只SPF级雄性成年Wistar大鼠随机分为三组:(1)健康对照组(n=15)、(2)脂多糖组(LPS 组，n=15)、血必净干预组(XBJ组，n=15)。血必净组在造模前半小时静脉内给予血必净4ml/kg，健康对照组和LPS组则给予等容积0.9%氯化钠注射溶液。在造模后6 h、12 h、24 h各随机处死大鼠5只，分别作为I、Ⅱ、Ⅲ亚组，无菌留取大鼠肺组织。

1.3.2 标本制备 在造模后6 h、12 h、24 h各随机处死大鼠5只，分别作为I、II、Ⅲ亚组，取右肺上、下叶组织用4%多聚甲醛固定，制成病理切片，分别采用苏木精-伊红(H-E)染色及免疫组织化学染色。

1.3.3 免疫组织化学法(IHC)检测肺组织中HMGB1蛋白表达 肺组织中HMGB1蛋白的检测采用SP法。石蜡包埋肺组织作5μm厚度的切片常规脱蜡，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，0.3%H2O2甲醇溶液消除内源性过氧化物酶，胰蛋白酶修复后，正常羊血清封闭非特异性抗原，滴加1∶50的羊抗大鼠HMGB1多克隆抗体，2℃过夜。PBS漂洗后滴加辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗后二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。以Image pro Plus5.1图像分析软件对肺组织免疫组织化学结果进行半定量分析，每张切片随机选5个不重复的视野，放大400倍，计算机自动测定并计算HMGB1阳性染色的积分光密度值(IOD)，分别取其平均值进行分析。

1.4 统计学处理 采用SPSSl3.0软件包分析，所有数据均采用均数±标准差(±s)表示，多组均数采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，组间两两比较采用SNK法。

2 结果

2.1 肺组织的病理形态学变化 光镜下，健康对照组大鼠肺组织结构完整，肺泡隔无水肿、无炎症，肺泡腔清晰。且各时间点无明显差异;LPS组大鼠肺组织结构基本消失，肺泡隔增宽，部分肺泡内见渗出、水肿、出血，肺间质见大量炎症细胞浸润。且随时间点增长而明显。XBJ组大鼠肺组织肺泡隔略有增宽，部分肺泡内见渗出、水肿、出血，肺间质见少量炎症细胞浸润。

2.2 肺组织HMGB1蛋白的表达 正常大鼠肺组织微弱阳性表达HMGB1，少量分布于肺泡和间质上皮细胞、小支气管黏膜上皮细胞。LPS组肺组织HMGB1强阳性表达，主要分布于肺泡上皮和间质上皮细胞、小支气管黏膜上皮细胞、肺泡和间质中大量的炎性细胞。XBJ组肺组织HMGB1阳性表达减轻。图像分析软件测定的积分光密度值提示，LPS各亚组较健康对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，XBJ各亚组较LPS组比较差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。

3 讨论

既往认为，早期促炎介质(包括 TNF-α、IL-1等)是引起肺损伤时机体失控性炎性反应与组织损害的关键介质，然而过去十余年中，临床采取TNF-α和IL-1拮抗剂治疗并未取得满意效果，提示可能存在晚期炎症介质参与病理反应。近年研究表明，HMGB1是一种关键的晚期促炎介质，在ALI/ARDS病程进展中发挥重要作用，使人们看到了肺损伤治疗的新希望。HMGB1是一种核内蛋白，最早被认为是基因转录中一种重要的因子［3］。1999年，Wang等［2］首次报道HMGBl作为新的潜在的晚期炎症介质，参与了脓毒症的发病过程，是内毒素致死效应的晚期重要炎症介质。HMGBl的致病作用的另一大特点是有维持和放大炎症作用。感染因素或非感染因素均可引起细胞主动或被动释放HMGB1［4］。通过晚期糖基化终末产物受体及TLR 4，2结合，HMGB1将信号传入细胞外环境。同时，研究发现，HMGB1可分泌到胞浆乃至胞外，与 IL-l、IL-6、TNF-α等重要炎症因子相互诱生并可引起炎症信号分子NF-κB的核移位。应用抗HMGB1抗体进行干预后，对严重内毒素血症、脓毒症、关节炎以及内毒素诱导的急性肺损伤均有积极的治疗作用。这些观察表明HMGB1是细胞损伤的关键介质，因此抑制它可以改善临床结果。

表1 三组大鼠不同时间点肺组织HMGB1的免疫组织化学表达(IOD±s，×103)

表1 三组大鼠不同时间点肺组织HMGB1的免疫组织化学表达(IOD±s，×103)

注:I、Ⅱ、Ⅲ亚组为6h、12h、24h各随机处死大鼠5只所检测结果;与对照组同时间点比较，a P＜0.05;与LPS组同时间点比较，b P ＜0.05

组别 鼠数(只) Ⅰ亚组(6h，n=5) Ⅱ亚组(12h，n=5) Ⅲ亚组(24h，n=5)对照组15 4.68 ±1.26 4.89 ±1.37 4.97 ±1.12 LPS 组 15 15.46 ±3.69a 27.21 ±4.35a 43.24 ±5.39a XBJ组 15 10.76 ±2.32ab 19.44 ±3.68ab 28.60 ±5.13ab

本实验采用大鼠股静脉注射LPS复制脓毒症肺损伤大鼠模型。免疫组织化学的研究结果显示，正常大鼠肺组织呈微弱阳性表达HMGB1，少量分布于肺泡和间质上皮细胞、小支气管黏膜上皮细胞，各时间点未见明显区别。LPS组肺组织HMGB1强阳性表达，主要分布于肺泡上皮和间质上皮细胞、小支气管黏膜上皮细胞，肺泡和间质中大量的炎性细胞，呈棕黄色染色。12h时间点可见较强阳性表达，且以24h为最强。Kim等［5］在失血性休克引起的肺损伤动物模型中也有同样的发现。同时我们在光镜下观察到肺泡隔增宽，部分肺泡内见渗出、水肿、出血，肺间质见多量炎症细胞浸润等明显肺损伤表现，本实验肺组织HMGB1表达与肺组织的病理损害程度基本一致。这些均证实肺组织HMGB1诱生与内毒素介导的急性肺损害关系密切。

以往的研究还表明HMGB1在损伤后相对晚期阶段表达，这一发现与我们的观察结果亦一致，即在LPS加入后12h肺组织HMGB1的水平明显增加。因此提示HMGB1在LPS诱导的肺损伤炎症及发展的过程中起着关键作用。

随着对ALI发生机制研究的逐步深入，寻找能减少早期和晚期炎性介质分泌的药物日益引起人们的关注。血必净是在古方血府逐瘀汤基础上精炼出的复方中药静脉制剂，由中药赤芍、川芎、丹参、红花、当归的提取物组成，具有很好活血化瘀、疏通络脉、溃散毒邪的作用。

本研究结果显示，应用血必净治疗后各时间点肺组织HMGB1蛋白表达均显著降低，同时肺组织病理形态学改变均有明显改善，提示血必净可有效降低肺组织HMGB1的表达，减少炎症因子的释放和炎性反应的扩大，减轻肺组织炎性反应，对脓毒症诱导的肺损伤具有一定治疗作用。

目前针对于血必净抗炎机制的多项基础研究尚处于初级阶段，许多问题还需进行深入研究，其是否能够作为危重病治疗药物有待进一步评价。从本实验结果证实ALI的发病过程中可能出现了晚期炎症因子HMGB1表达的上调，运用血必净治疗脓毒症ALI后能够抑制大鼠肺组织HMGB1的表达水平，改善ALI时的炎性反应，减少白细胞渗出，减轻肺水肿及肺组织病理损伤，对大鼠脓毒症肺损伤有明显保护作用，预示着血必净具有良好的临床应用前景，可能会给脓毒症的治疗带来希望。

［1］ Julie A，Lorraine B，Gordon R.The role of the coagulation cascade in the continuum of sepsis and acute lung injury and acute respiratory distress syndrome［J］.Semin Respir Crit Care Med，2006，27(4):365-376.

［2］ Wang H，Bloom O，Zhang M，etal.HMG-1 as a latemediator of endotoxin lethality in mice［J］.Science，1999，285(5425):248-251.

［3］ Bustin M.Regulation of DNA-dependent activities by the functional motifs of the high-mobility-group chromosomal proteins［J］.Mol Cell Biol，1999，19(8):5237-5246.

［4］ Fang WH，Yao YM，Shi ZG，et a1.The significance of changes in high mobility group-1 protein mRNA expression in rats after thermal injury［J］.Shock，2002，17(4):329-333.

［5］ Kim JY，Park JS，Strassheim D，et al.HMGB1 contributes to the development of acute lung injury after hemorrhage［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005 ，288(5):958-965.