黄芪皂苷Ⅳ对大鼠脑缺血/再灌注损伤海马神经元凋亡及相关基因表达的影响

王莹，李文媛，郑海星，佟晓杰

(1.牡丹江医学院解剖教研室，牡丹江157011;2.中国医科大学解剖教研室)

脑缺血后恢复脑血流是治疗脑缺血最关键的方法，但再灌注后可加重缺血脑组织的损伤，这种损伤以凋亡为主，因此减少缺血/再灌注后神经元凋亡为重要的脑保护机制。细胞凋亡是由特定的基因调控的，Bcl-2家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用，其包括促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2，这两种基因相互协调，共同对缺血神经元的凋亡进行调控［1］。黄芪是一种被广泛应用于治疗缺血性脑血管病的传统中药，具有补气升阳、利水退肿的功效［2-3］。黄芪皂苷Ⅳ是一种纯化小分子皂苷(分子量784)，是黄芪的主要活性成分，有研究显示黄芪皂苷Ⅳ具有降压［4］调节机体免疫功能［5］、抗炎症［6］、镇静镇痛［7］、神经保护［2］、降低病毒活性［8］等多种药理作用。尽管黄芪皂苷Ⅳ在病理条件下能够发挥多种作用，但其在脑缺血再灌注后对细胞凋亡的影响仍不明确。本研究通过观察黄芪皂苷Ⅳ对CIR后大鼠海马神经元细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，探讨黄芪皂苷Ⅳ对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性 SD大鼠42只，清洁级，体质量280～320 g，购于中国医科大学实验动物中心(许可证号:SYXK［辽］2003-0013)。

1.2 试剂和药物 黄芪皂苷Ⅳ(西安赛邦医药)，纯度98%。用时以0.9%氯化钠注射溶液配成质量浓度为1.0 g/L。尼莫地平注射液(河北医科大学制药厂)，规格20 mg/100 ml，用时以0.9%氯化钠注射溶液配成质量浓度为0.1 g/L。Bcl-2、Bax多克隆抗体、免疫组织化学SP试剂盒、TUNEL试剂盒购于北京中山生物试剂公司。

1.3 动物模型制备与分组 大鼠按体质量分层，随机分为4组:假手术组(n=6)、模型组(n=12)、尼莫地平对照组(n=12)、黄芪皂苷Ⅳ组(n=12)。参照Longa等［10］的线栓改良法复制大鼠左侧大脑MCAO局灶性脑缺血模型。各组于缺血前5 min第1次给药，腹腔注射，缺血后12 h给药1次，共给药2次。黄芪皂苷Ⅳ给药剂量为20 mg/kg，尼莫地平注射液给药剂量为1 mg/kg，均为临床等效剂量。假手术组和模型组给予等体积0.9%氯化钠注射溶液。术后当日给大鼠饮水，次日开始自由饮食。

1.4 免疫组织化学检测 取材行冰冻切片，在视交叉后1～4 mm处冠状切面切开，在海马齿状平面连续冠状切片，片厚 4μm。0.5%过氧化氢孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后，滴加稀释后的一抗 Bcl-2(1∶80)、Bax(1∶80)，4 ℃ 过夜。滴加生物素标记体，30 min，37℃。滴加过氧化物-链霉素卵白素37℃，30 min。DAB显色液显色，苏木精复染。以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片，400倍光镜下每张切片在海马随机选5个阳性视野，目镜测微网400倍放大下为面积单位，计数网格中阳性细胞数，重复3次，取其平均值。

1.5 凋亡神经元的检测 采用原位末端TUNEL标记法检测。将甲醛固定大鼠海马组织标本常规脱水，石蜡包埋，连续切片，厚4μm，脱蜡后按照In situApoptosis Detection Kit说明书操作;阴性对照采用 pH 7.2 ～7.6，0.01 mol/L PBS 代替 TUNEL 反应液。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片，每张切片在海马随机选5个视野，400倍光镜下应用目镜阳性细胞所占的百分比。细胞凋亡指数(AI)=凋亡阳性细胞总数/细胞总数。

1.6 统计学处理 所得数据以采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以均值±标准差(±s)表示，进行方差分析和t检验。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色 Bcl-2、Bax阳性表达主要位于核膜，其次在内质网和线粒体外膜也有分布，因此阳性细胞胞质可见细小的棕黄色颗粒。假手术组大鼠脑组织中未见Bcl-2、Bax阳性表达。模型组Bcl-2、Bax阳性细胞表达较假手术组差异显著(P＜0.01)。尼莫地平对照组Bcl-2、Bax蛋白表达与模型组无差异(P＞0.05)。与模型组和尼莫地平对照组比较，黄芪皂苷Ⅳ组Bax蛋白表达明显下降(P＜0.05)，Bcl-2 蛋白表达(P ＜0.05)和 Bcl-2/Bax比值显著升高，见表1。

2.2 TUNEL检测结果 假手术组脑组织未见细胞凋亡。模型组、尼莫地平对照组、黄芪皂苷Ⅳ组均可见到海马CA1区细胞凋亡，凋亡细胞胞质呈棕褐色和棕黄色着色，胞核固缩颗粒深染，呈圆形、椭圆形及不规则形。模型组凋亡细胞指数较假手术组显著增加(P＜0.01)，黄芪皂苷Ⅳ组凋亡细胞指数明显少于模型组和尼莫地平对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。

表1 海马神经元细胞凋亡指数、Bcl-2、Bax阳性细胞表达情况(±s)

表1 海马神经元细胞凋亡指数、Bcl-2、Bax阳性细胞表达情况(±s)

注:与假手术组比较，a P＜0.01;与模型组比较，b P＜0.05;与尼莫地平组比较，c P＜0.05

组别 鼠数(只)Bcl-2阳性数(/mm2) Bax阳性数(/mm2) Bcl-2/Bax比率 凋亡指数(%)假手术组60000模型组 6 167.56 ±24.48a 382.65 ±16.63a 0.437 18.35 ±11.71a尼莫地平组 6 180.43 ±22.25a 355.72 ±19.58a 0.507 17.29 ±9.56a黄芪皂苷Ⅳ组 6 270.05 ±25.54bc 295.34 ±20.79bc 0.915 12.64 ±10.22bc

3 讨论

脑缺血性损伤的机制和防治一直是该领域研究的热点，海马神经元对缺血具有选择性敏感，短暂性脑缺血即可导致该区神经元的迟发性死亡(DND)，随着研究的深入，人们发现短暂脑缺血后海马出现DND与细胞凋亡密切相关。

作为细胞凋亡过程中最主要的调控基因之一，Bc1-2基因过度表达可特异性抑制细胞凋亡，在轴突的生长和再生中起关键作用［9］，已有实验显示Bcl-2可作为脑损伤后的基因治疗［10］，并与脑缺血损伤预后正相关［7］。而Bax基因的过度表达则可对抗Bc1-2对细胞凋亡的抑制作用，其高表达可能是脑损伤后细胞凋亡增加的主要原因，能够促进缺血区神经元死亡［9］。严重脑损伤大鼠脑组织 Bax表达明显增加，Bcl-2/Bax 比值下降［11］。Hara 等［12］认为Bc1-2/Bax比率决定细胞受到凋亡刺激信号后是生存还是凋亡。本研究表明，模型组可见到海马神经元Bcl-2和Bax表达较假手术组显著表达(P＜0.01)，且与凋亡分布一致，这与以往研究结果基本一致［13］，提示两者与脑缺血损伤诱导的细胞凋亡密切相关。进一步观察发现，与尼莫地平对照组和模型组相比，黄芪皂苷Ⅳ能明显上调Bc1-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，升高Bc1-2/Bax比值，降低神经元细胞凋亡指数。

综上所述，黄芪皂苷Ⅳ能够抑制脑缺血再灌注损伤海马神经元细胞凋亡，其机制可能与上调Bcl-2表达，下调Bax表达，升高Bc1-2/Bax比值有关。对黄芪皂苷Ⅳ抗神经细胞凋亡机制详细分子机制可能有多种，本实验仅探索到其中的一小部分，如进行深入研究，可能会发现更多的途径及机制，为黄芪皂苷Ⅳ临床应用提供新的理论依据。

［1］ 曲鹏，乔春萍，方秀斌.凋亡相关基因与脑缺血再灌注损伤［J］.解剖科学进展，2006，12(1):52-56.

［2］ Luo Y，Qin Z，Hong Z，et al.Astragaloside IV protects against ischemic brain injury in amurinemodelof transient focal ischemia［J］.Neurosci Lett，2004，363(3):218-223.

［3］ Cai YH，Qin Z，Yao QL.A prospective，pilot study of astragalusmembranaceus in the treatment of acute cerebral infarction［J］.Clin Neurol，1994，7(6):216-218.

［4］ ZhangWD，Zhang C，Liu RH，et al.Preclinical pharmacokinetics and tissue distribution of a natural cardioprotective agent astragaloside IV in rats and dogs［J］.Life Sci，2006，79(8):808-815.

［5］ Li Z，Cao Q.Effects of astragaloside IV onmyocardial calcium transport and cardiac function in ischemic rats［J］.Acta Pharmacol，2002，23(10):898-904.

［6］ Zhang W，Binder B.Anti-inflammatory activity of astragaloside IV ismediated by inhibition of NF-kappa B activation and adhesion molecule expression［J］.Thromb Haemost，2003，90(5):904-914.

［7］ Yang Q，Lu JT，Zhou AW，et al.Antinociceptive effect of astragalosides and itsmechanism of action［J］.Acta Pharmacol，2001，22(9):809-812.

［8］ Lu S，Zhang J，Yang D.Effects of astragaloside IV in treatingmyocardial injury and myocardial sarco/endoplasmic Ca2+ATPase of viralmyocarditismice［J］.Chin J Integr Med，1999，19(11):672-674.

［9］ Xing B，Chen H，Zhang M.Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat［J］.Stroke，2008，39(8):2362-2369.

［10］ Bu Y，Zhang PY，Geng DQ，et al.Effects of electroacupuncture plus oxygenmedicine on the expression of Bcl-2 and Bax proteins in the hippocampal CA 1 area in rats with global cerebral ischemia/reperfusion injury［J］，Zhen Ci Yan Jiu，2010，35(3):208-212.

［11］ 谭永星，王迪芬，李雪梅，等.神经生长因子预处理对沙土鼠全脑缺血/再灌注损伤脑神经细胞凋亡及Bcl-2及Bax蛋白表达的影响［J］.中国危重病急救医学，2007，19(6):358-360.

［12］ Hara A，Iwai T，Ni Wa M，et al.Immunohistochemical detection of Bax and Bc1-2 Proteins in gerbil hippocampus following transient forebrain ischemia［J］ .Brain Res，1996，711(1/2):249-253.

［13］ Strosznajder R，Gajkowska B.Effect of 3-aminobenzamide on Bcl-2，Bax and AIF localization in hippocampus neurons altered by ischemia-reperfusion injury［J］.Acta Neurobiol，2006，66(1):15-22.