对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法检测水溶液中常微量尿素

苗晓杰，蒋恩臣，王 佳，杜衍红

（华南农业大学工程学院，广州 510640）

目前，国内外测定尿素含量的方法主要有尿素酶法[1]、硫酸消煮甲醛法和二乙酰单肟比色法[2]。尿素酶法是在一定酸度的溶液中用尿素酶将尿素态氮转化为氨，再用硫酸标准溶液滴定。此方法用于检测含有尿素酶活性抑制剂的缓释尿素时存在反应时间长，转化不完全等问题，使得测试值和真实值之间有很大差异[3]。硫酸消煮甲醛法则操作繁琐，滴定终点不易判断，其中使用的化学试剂甲醛对人体肾脏、眼膜等器官都有损害[4]。二乙酰单肟比色法检测限低，可以测定微量尿素，但是其操作步骤繁琐，热稳定性差，精密度和准确度都不够理想。

对二甲氨基苯甲醛能够在酸性条件下和尿素反应生成柠檬黄色物质，可依此用比色法测定尿素含量[5－6]。虽然有些研究者据此提出一些具体检测方法[3－4,7－8]，但大多存在所用试剂定量不够精确，操作步骤不够清晰等问题，本文在参考国内外有关资料的基础上，多次进行实验和探索论证，提出了以对二甲氨基苯甲醛为显色剂，利用分光光度法检测水中常量尿素的具体可行方法。

1 实验原理

根据Ehrlich反应原理，对二甲氨基苯甲醛[（CH3）2NC6H4CHO]可以和各种含氮有机化合物发生显色反应。对二甲氨基苯甲醛与尿素 [(NH2)2CO]反应可生成柠檬黄色物质。其反应方程式为：

2 试验材料与仪器

可见分光光度计（V－1100，上海美谱达仪器有限公司）；

25 mL比色管，1 cm玻璃比色皿；

无水乙醇（分析纯），对二甲氨基苯甲醛（分析纯），硫酸（分析纯），尿素（分析纯）；

对二甲氨基苯甲醛（PDAB）显色剂：称取20.00 g对二甲氨基苯甲醛溶解于1 000 mL无水乙醇中；

2 mol·L－1硫酸溶液：按 V（浓硫酸）∶V（水）=1∶8配制；

1 000 μg·mL－1尿素标准溶液：称取 1.000 g（称准至0.0001 g）尿素溶解于1 000 mL去离子水中。

3 试验方法与结果分析

3.1 条件试验

3.1.1 波长的选择

取 10 mL 1 000 μg·mL－1的尿素标准溶液加入25 mL比色管中，加入PDAB显色剂10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液3 mL，再加入2 mL去离子水，混合摇匀，静置10 min。然后以空白试剂为参比，在不同波长下测定其吸光度。空白试剂的配制方法为：取10 mL去离子水加入25 mL比色管中，加入PDAB显色剂10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液3 mL，再加入2 mL去离子水，混合摇匀，静置10 min。所得试验结果如图1所示。

图1 尿素与对二甲氨基苯甲醛反应溶液在不同波长下的吸光度Fig.1 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea under different wavelength

从图中的函数图像以及对应的点的坐标数据可以看出，尿素样品反应溶液在400～460 nm范围内有一个强烈的吸收峰，在422 nm处有最大吸收值1.545。故选用422 nm作为试验所用波长。

3.1.2 PDAB显色剂用量的选择

固定 1 000 μg·mL－1尿素标准溶液加入量 10 mL，2.0 mL·L－1硫酸溶液加入量3 mL，改变PDAB显色剂的用量，用去离子水定容至25 mL，在比色管中混合均匀静置10 min后，在422 nm下测定反应溶液的吸光度以及对应空白试剂的吸光度，此处对应空白试剂是指以等量去离子水代替尿素标准溶液，其余配比跟对应样品溶液相同。所得试验数据如表1所示。

表1 PDAB显色剂用量对尿素与对二甲氨基苯甲醛反应溶液吸光度的影响Table 1 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of PDAB

在给定条件下，随着PDAB显色剂加入量的增大，反应溶液的吸光度不断增大，在PDAB显色剂为10 mL时达到最大值，而后开始减小。空白试剂的吸光度则随PDAB显色剂加入量的增大而不断增大。根据样品反应溶液的吸收尽量大，空白试剂的吸收尽量小的原则，选定10 mL作为PDAB显色剂的用量。

3.1.3 硫酸溶液用量的选择

固定 1 000 μg·mL－1尿素标准溶液加入量 10 mL，PDAB 显色剂的用量 10 mL，改变 2.0 mol·L－1硫酸溶液加入量，用去离子水定容至25 mL，在比色管中混合均匀静置10 min后，在422 nm下测定反应溶液的吸光度以及对应空白试剂的吸光度，此处对应空白试剂是指以等量去离子水代替尿素标准溶液，其余配比跟对应样品溶液相同。所得试验数据如表2所示。

表2 硫酸溶液用量对尿素与对二甲氨基苯甲醛反应溶液吸光度的影响Table 2 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of sulfuric acid

在给定条件下，随着硫酸溶液加入量的增大，反应溶液的吸光度不断增大，在硫酸溶液从4 mL变化到5 mL时增幅急剧减小。空白试剂的吸光度随硫酸溶液加入量的增大而增大，在硫酸溶液从4 mL变化到5 mL时增幅也急剧减小。在硫酸溶液为4 mL时，反应溶液和空白试剂的吸光度之差为1.561，硫酸溶液为5 mL时，反应溶液和空白试剂的吸光度之差为1.560。测定尿素含量时若以空白试剂做参比，过强的背景吸收必然增大样品吸光度的离差，直接影响方法的精度和检出能力。根据样品反应溶液的吸收尽量大，空白试剂的吸收尽量小的原则，选定4 mL作为硫酸溶液加入量。

3.1.4 显色反应时间的选择

取 10 mL 1 000 μg·mL－1的尿素标准溶液加入25 mL比色管中，加入PDAB显色剂10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液4 mL，再加入1 mL去离子水，混合摇匀。然后在440 nm下，以去离子水为参比，测定其不同时间吸光度，同时测定空白试剂的吸光度。空白试剂的配制方法为：取10 mL去离子水加入25 mL比色管中，加入PDAB显色剂10 mL，2 mol·L－1硫酸溶液 4 mL，再加入 1 mL去离子水，混合摇匀。所得试验数据如表3所示。

尿素与对二甲氨基苯甲醛反应，溶液显色反应在5 min内即可基本完成，在反应时间为10～600 min内，显色溶液的吸光度非常稳定，长时间放置后所测结果会稍微有所增大。综合以上分析，确定显色反应时间为10 min。

表3 尿素与对二甲氨基苯甲醛反应溶液在不同显色时间下的吸光度Table 3 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by reaction time

3.2 标准曲线和测试方法的建立

3.2.1 标准曲线

取 8 支 25 mL 比色管，分别加入 1 000 μg·mL－1的尿素标准溶液 0、0.5、1、2、4、5、8、10 mL，然后分别补充去离子水10、9.5、9、8、6、5、2、0 mL定容到10 mL刻度处，由此可以得到各为10 mL的尿素含量分别为0、50、100、200、400、500、800、1 000 μg·mL－1的系列溶液。然后在每支比色管中，加入PDAB显色剂10 mL，2 mol·L－1的硫酸溶液4 mL，然后加入去离子水定容至25 mL刻度处，混合摇匀，静置10 min。然后以第一支比色管的反应溶液（即空白试剂）做参比溶液，在422 nm下分别测定8支比色管反应溶液的吸光度。所得结果如表4所示。

通过数据分析软件SPSS（13.0版本）进行线性回归分析，得到显色溶液吸光度Y与尿素含量X（μg·mL-1）的关系式：X（尿素浓度，μg·mL-1）=628.871*Y（吸光度）-5.742（R=1.000，R2=1.000），两者呈现出极显著的线性关系。回归直线如图2所示。

表4 不同浓度尿素与对二甲氨基苯甲醛反应溶液的吸光度Table 4 Absorbency of solution produced by PDAB reacting with urea affected by dosage of sulfuric acid

图2 对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量标准曲线Fig.2 Standard curve of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

3.2.2 测试方法

取待测样品溶液10 mL加入25 mL比色管中，加入PDAB显色剂10 mL，2 mol·L-1的硫酸溶液4 mL，然后加入去离子水定容至25 mL刻度处，混合摇匀，静置10 min后，在422 nm下，以空白试剂为参比，测定其吸光度。然后把吸光度带入到标准曲线方程式中，通过换算就可求出待测样品所含尿素浓度。空白试剂的配制方法为：取10 mL去离子水加入25 mL比色管中，加入PDAB显色剂10 mL，2 mol·L-1硫酸溶液4 mL，再加入1 mL去离子水，混合摇匀，静置10 min。若待测样品尿素含量浓度过高，则可以适当稀释后再进行显色测定。

3.3 精密度与准确度试验

分别配制低中高6种浓度的尿素标准溶液，以空白试剂做参比溶液，在前文所选定的试验条件下分别测定吸光度，每个样品溶液重复测定8次，结果见表5。

表5 对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量精密度与准确度试验Table 5 Precision and accuracy experiment of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

然后把测得的吸光度值带入标准曲线方程求得尿素浓度，利用数据分析软件SPSS（13.0版本）计算平均值并进行误差和偏差分析，同时与利用二乙酰单肟比色法方法测得的数值进行对比。结果见表6。

表6 对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量精密度与准确度试验Table 6 Precision and accuracy experiment of spectrophotometry with PDAB as chromogenic agent to determine urea concentration

从数据软件分析结果可以看出，利用对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量，由标准曲线求得的尿素浓度平均值与标准样品的尿素浓度的绝对误差较小，相对误差低于0.51%，中高浓度相对误差不超过0.30%。标准偏差较低，相对标准偏差（变异系数）不超过10‰，表明方法具有较高的精密度和准确度。阶梯加标回收率在99.08%～100.74%之间，表明可以采用线性校准方法，标准曲线具有较高的稳定性和可靠性[9]。与二乙酰单肟比色法方法测得的值比较可以看出，对同一浓度样品，两种方法测定的结果差别不大，这从另一方面验证了对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量的准确性和可靠性。

3.4 检出限和干扰分析

利用对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量，显色溶液吸光度与尿素含量两者呈现出极显著的线性关系。根据分光光度法检出限的确定原则[10]，一般以能给出吸光度为0.010的溶液浓度为检出限。把这一数值带入所建立的标准曲线方程，可以求得本方法的检出限为0.5 μg·mL－1，若检测高浓度尿素溶液，可以先进行适当稀释；检测超低浓度的尿素溶液，可以配制更低浓度的标准尿素溶液，建立新的标准曲线或者选择其他方法。

关于测试样品中干扰的问题通常有以下情况：①氨的干扰。氨的干扰在于消耗酸，通过酸度改变使样品和试剂的色度发生变化。酸度降低时，溶液吸光度会下降，但氨溶于水后生成的铵离子对色度具有微弱的增强作用，可以部分补偿溶液色度的降低。此外可以采用加大酸用量的方法消除氨的影响。②联氨的干扰。低浓度的联氨不会产生干扰，因为对二甲氨基苯甲醛对尿素的敏感度远远大于联氨，若样品中有较高浓度联氨存在时，可以采用加碘氧化法除去。③Fe3+的干扰。Fe3+在水溶液中显黄色，其色度会对测试结果产生影响，可以借助还原剂（抗坏血酸、盐酸羟胺等）将Fe3+还原为Fe2+消除其影响。对于普通水溶液中常见的其他物质，尚未发现干扰。

4 结论

本文通过条件试验，精密度和准确度试验，建立了对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量的标准曲线和操作步骤。利用对二甲氨基苯甲醛显色分光光度法测定尿素含量具有精密度高、准确度高、稳定性好、操作性强、步骤简便等优点，适用于水溶液中常微量尿素含量的测定。

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