微生物发酵法生产纳豆工艺条件的优化研究

刘 晶，李红玲，王 妍，江连洲，于殿宇

（东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

纳豆是由大豆经纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）发酵而成的一种发酵豆制品。纳豆最早起源于中国[1－2]，后来传入日本。纳豆在日本盛行一千多年，并形成了丰富的纳豆文化。日本民间有：“纳豆顿顿有，活到九十九”的口头禅[3]。大豆发酵成纳豆后，大豆蛋白质经微生物酶的作用转化成可溶性的多肽和氨基酸，有利于人体吸收[4]。纳豆芽孢杆菌是纳豆生产中最重要的因素，也是纳豆中最重要的有效成分。经纳豆芽孢杆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候，可以产生出无数酵素和维生素，并可在纳豆的周围产生多聚谷氨酸和多聚果糖的混合性粘性物质[5]，具有神奇的功效。纳豆芽孢杆菌具有溶血栓、降血压、抗肿瘤、抗菌、防止骨质疏松等功能[6]。发酵成熟后的纳豆含有大量的纳豆芽孢杆菌，故具有溶血栓、抗肿瘤、降血压、血脂及预防动脉粥样硬化、抗氧化、抑菌等多种功能[7]。

现在世界各国的发酵工业都比较发达,发酵产物的提取工艺也比较完善。而微生物的生长速度快，生长条件易于控制，因而可以通过人工控制发酵条件来获得大量的目的产物。因此，对由微生物所产的各种发酵产物的研究将有广阔的发展前景[8]。

传统的纳豆发酵工艺流程为精选大豆→流水浸泡（14 h）→蒸煮（130℃）→接种发酵（24 h）→成熟（5℃下40℃95%湿度10 h；38℃85%湿度11 h）纳豆的生产在日本已有上千年的历史，因此工艺十分成熟，随着科学技术的进步及对纳豆所含功能性成分的探讨，在生产纳豆方面又有新的发展[9]。

本试验利用微生物发酵的方法，将提取出的纳豆芽孢杆菌接种到蒸煮的大豆中，进而对纳豆生产的工艺条件进行优化研究，以期得到较好纳豆生产工艺，并以此工艺条件为基础进行纳豆的实际生产，达到提高产量、缩短生产周期，降低成本的目的，并使产品具有营养价值高、风味独特、价格低廉的特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

非转基因大豆，市售（含水量14.2%，蛋白质含量约50%）；纳豆，哈尔滨日尚食品有限公司。

牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、水等所用试剂均为分析纯，菌株由本实验室分离筛选保藏菌株。

1.1.2 培养基

纳豆芽孢杆菌固体/斜面培养基：牛肉膏0.6 g，蛋白胨2.0 g，氯化钠1.0 g，琼脂3.0 g，水200 mL。

1.1.3 试验设备

YXQ-280MD型手提式压力蒸汽消毒器（哈尔滨松花江医疗器械厂）；HZQ-X100A型恒温摇床（上海一恒科学仪器有限公司）；PB602-N型电子分析天平（梅特勒一托利多仪器上海有限公司）；SWCJ-2FD型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司制造）。

1.2 方法

1.2.1 试验流程

挑选市售非转基因、颗粒饱满、无虫咬无霉烂、整粒大无畸形、色泽淡黄的大豆，清水冲洗，直至无杂物，豆水比1∶3浸泡12 h后，分装入三角瓶放在高压蒸汽灭菌锅中蒸煮30 min，随即取出放入无菌操作台内进行冷却。将从纳豆中提取、分离得到纳豆芽孢杆菌（实验室提供）接种到冷却的蒸煮大豆中，放入恒温震荡培养箱中，在一定温度下进行不同时间的恒温震荡培养后，将三角瓶放在4℃下后熟。

1.2.2 纳豆的感官评价

纳豆的感官鉴定标准如表1所示[10]。参与感官评定的人员为东北农业大学食品学院在校学生28人，首先，对哈尔滨日尚食品有限公司的纳豆进行感官评价，随后对本试验所产的纳豆进行感官评价。

表1 纳豆的感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of natto

1.2.3 纳豆中主要成分测定

纳豆中水分采用蒸馏法测定样品中水分含量[11]；采用凯氏定氮法测定纳豆中蛋白质含量[12]。纳豆中粘多糖的测定参照文献[13]。

纳豆中的粘液是由粘多糖组成的，所以测得纳豆的粘液率即为纳豆中粘多糖的含量。准确称取5.0000 g纳豆，一式2份，一份直接在105℃烘箱中烘至恒重W1，另一份用温水轻轻地洗掉纳豆表面的粘液，再将纳豆移入烘箱中烘至恒重W2，所得数据即为粘液产率（X），重复3次取平均值，计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 发酵温度对纳豆感官的影响

接种了纳豆芽孢杆菌的大豆分别在31～39℃下发酵24 h，后熟时间为24 h对发酵后的纳豆进行感官评定，评定结果如表2所示。

从表2中可以看出纳豆芽孢杆菌的最适发酵温度为35℃。当发酵温度过低或过高时会影响纳豆芽孢杆菌生长，导致菌种的生长速度会降低，合成粘性物质所需的多种胞外酶产量降低，纳豆的透明度差、黏度小，从而影响了粘性物质的合成和纳豆风味物质的形成，而造成纳豆的拉丝性降低风味差。

表2 发酵温度对纳豆感官的影响Table 2 Effect of fermentation temperature on the sensory quality of natto

2.2 发酵时间对纳豆的影响

接种了纳豆芽孢杆菌的大豆分别在35℃下发酵18～42 h，后熟时间为24 h，对发酵后的纳豆进行感官评定，评定结果如表3所示。

由表3可知，纳豆芽孢杆菌的最佳发酵时间为24 h。随发酵时间的延长，纳豆的气味逐渐形成，纳豆特有的香气产生，但当发酵时间过高，纳豆的味道变得过于浓厚，严重影响纳豆的味道。

表3 发酵时间对纳豆感官的影响Table 3 Effect of fermentation time on the sensory quality of natto

2.3 后熟时间对纳豆的影响

接种了纳豆芽孢杆菌的大豆分别在35℃下发酵24 h后，经过18～36 h的后熟后，对发酵后的纳豆进行感官评定，评定结果如表4所示。

由表4可知，最佳后熟时间为24 h。该试验随着后熟时间的升高，纳豆由最初的淡黄色变成金黄色，而且有光泽，但当温度过高，纳豆的色泽开始逐渐变成暗褐色。

2.4 正交试验

选用L9（33）正交表进行纳豆生产工艺的正交试验，确定最佳发酵温度、发酵时间和后熟时间等反应条件，以得到感官质量好的纳豆。

分别对以上三个因素的几种水平对工艺效果影响进一步分析：

发酵温度：生产纳豆的发酵温度为35℃时纳豆的拉丝性最好、不易断，因此发酵温度35℃为最优水平；发酵时间：生产纳豆的发酵时间在24 h时，有浓重的纳豆香味，即此条件为最优水平，所以选择发酵时间为24 h；后熟时间：纳豆的后熟时间在24 h的条件下，纳豆的颜色呈金黄色并带有色泽，后熟时间为24 h时是本条件的最优水平。

结果见表5，6。

表4 后熟时间对纳豆感官的影响Table 4 Effect ripened time on the sensory quality of natto

表5 纳豆工艺正交试验因素水平Table 5 Factors natto process level orthogonal test table

表6 正交试验因素水平Table 6 The level of orthogonal test

综上所述，通过正交试验见表6，可以得出发酵时间＞发酵温度＞后熟时间，由R值可知，发酵时间和发酵温度对纳豆的生产影响较大，其次是后熟时间。选择最优试验条件为A2B1C1，从试验组看出应选择A2B1C2。

做两组发酵温度为35℃、发酵时间24 h、后熟时间分别为18和24 h时，对两组纳豆感官进行评价，最终得出发酵温度为35℃、发酵时间24 h、后熟时间24 h是最佳工艺条件。

3 讨论

为以后纳豆的工业化生产提供了一定的基础。2003年纳豆在日本方兴未艾，每年以大于10%的速度急剧增长，年产、消费纳豆近20万t，销售额已近2 000亿日圆。而且，在香港地区、韩国和美国，纳豆也得到不少人的喜爱。本试验所确定的工艺参数与传统的直接接入纳豆芽孢杆菌生产纳豆的方法来比，采用微生物提取法所确定的工艺参数来作为生产参数，水分、蛋白质及粘多糖含量均较传统工艺提高，所生产出的纳豆口味最佳。本试验在生产工艺上更加具体化了纳豆的生产条件，使纳豆的品质（感官品质和成分含量）明显提高。相信在我国，随着人口的不断老化和人们对纳豆的营养和保健功能的认识，具有多种保健功能的纳豆的开发前景必将十分广阔。纳豆在我国的发展前景甚好，对我国传统食品要进一步的改进和开发起到了一定的促进作用，事实上我国传统食品豆豉在生产原料，生产用菌、生产工艺都与纳豆有相似之处，经科学家试验证明，豆豉的营养几乎与牛肉相当，并含有大量能溶解血检的昼夜激素，能有效地预防脑血检的形成，对改善大脑的血流量和防治老年性痴呆症等作用。现今我们应大力发展和开发我国传统食品，更进一步的完善食品行业。

4 结论

本试验通过对纳豆生产工艺影响因素发酵时间、发酵温度、后熟时间的研究确定纳豆的最佳工艺条件为：发酵时间24 h，发酵温度35℃，后熟时间24 h。采用此工艺参数生产出的纳豆水分、蛋白质及粘多糖含量分别为61.8%、19.34%和5.08%。而市售纳豆中的水分、蛋白质及粘多糖含量分别占纳豆总量的60.4%、19.26%和4.18%，可见，纳豆的水分、蛋白质及粘多糖含量较传统的发酵方法分别提高了1.4%、0.08%和0.9%，此时的纳豆口味最佳。

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