DNA条形码的应用进展及讨论

武宇鹏，丁 亮，李 捷，武春生，范仁俊，朱朝东*

(1.山西大学黄土高原研究所，太原 030006;2.中国科学院动物研究所动物进化与系统学院重点实验室，北京 100101;3.山西省植保植检总站，太原 030001;4.山西省农业科学院植物保护研究所，太原 030031)

1 DNA条形码产生的背景

分类学是生物学的基础，是人类认识自然的第一步。自林奈创立双名法近250年来，已经有170多万个物种被命名。目前全球生物估计的物种数量至少有 1亿种 (Erwin，1982;May，1990;Stock，1993)。如此巨大的数量，单靠专业的经典分类学家，几乎是不可能完成的任务。以平均一个经典分类学家一生鉴定1000个物种的标准来计算，需要1万多个经典分类学家同时参与完成。由于经典分类学方法具有局限性，很难同时、有效地对某一个地区、某一个项目或某一次大型考察所得到的全部生物样本进行鉴定与记录。以现在人类社会生产力发展的需求来看，亟需一种更加具有效率的生物物种鉴定体系，更好地为生产生活服务;况且现有物种正以每年1～2万种的速度在灭绝，也亟需一种更加具有效率的生物物种鉴定与记录体系，为人类进一步深入全面地认识自然界和评估自身存在留备更加系统的物种本底资料。

近20年来，快速发展的分子生物学技术为众多传统学科提供了新的发展机遇，分类学亦不例外。利用DNA进行物种鉴定已经成功应用到了多个生物类群中 (Hebert et al.，2004a;Ward et al.，2005;Barber et al.，2006;Chantangsi et al.，2007;Smith et al.，2008)。国际互联网DNA数据平台的构建，使得大量物种基因信息第一时间公示，例如美国国家生物技术信息中心NCBI(National Center of Biotechology Information)的GenBank数据库中生物基因数据爆炸式增加。但在分类学中，尚缺乏一个专门将DNA序列与分类学相结合的标准。

在此趋势之下，Tautz等 (2002)首先提出DNA分类的概念 (DNA Taxonomy)，以DNA序列为基础建立物种识别体系，利用DNA序列的差异进行种级阶元的分类，并与林奈命名系统一一对应。利用此体系可以鉴定物种，也可以解决一些形态学上的难题，发掘隐存种。Tautz等 (2003)指出，虽然DNA测序技术是昂贵的，但培养一个分类学专家所花成本更大，而且需要长时间的投入，DNA分类是未来分类学发展的必然趋势。

随后，Herbert等 (2003a)提出DNA条形码概念 (DNA Barcoding)。针对形态学分类固有的缺陷，如表型可塑性和遗传可变性，无法鉴定隐存分类单元和不同发育阶段的物种等，Herbert倡导利用线粒体COⅠ基因 (线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因)作为通用序列，建立全球性的物种鉴别系统。与其它基因片段相比，COⅠ基因有许多优点，相对保守又有足够的变异，并且序列长度适中 (Hebert et al.，2003b)。DNA条形码系统的建筑流程为预先收录已知种名物种的COⅠ基因建立一个庞大的条形码数据库，将未知种名物种的COⅠ基因输入数据库进行检索，根据序列相似度来快速鉴定物种，解决实际问题并不断丰富数据库。这个过程类似于超市利用给商品添加条形码，分类管理成千上万种不同的商品，故称之为DNA条形码。

2003年，全球多位生物学专家在美国冷泉港召开了两次会议，深入讨论了DNA条形码的科学性和社会功能，提出了国际DNA条形码计划——iBOL(International Barcode of Life)。2004年，“生命条形码联盟”(CBOL，the Consortium for the Barcode of Life)成立，至今已经有来自50个国家的170多个组织成为其会员 (http:∥barcoding.si.edu/)。目前，针对全球鸟类的计划:All Birds Barcoding Initialtive(www.barcodingbirds.com)、全球鱼类计划:Fish Barcode of Life Initiative(www.fishbol.org)、鳞翅目昆虫计划:All Leps Barcode of Life(www.lepbarcoding.org)、极地生物计划:Polar Barcode of Life(www.polarbarcoding.com)等DNA条形码项目正在实施中 (关申民等，2008)。2007年5月，加拿大圭尔夫大学正式筹建生命条形码数据库系统 (Barcode of Life Data Systems，BOLD)。该数据库不仅包括序列信息，也包括完整的物种描述、地理分布信息、标本图片等。

有关DNA条形码的学术论文也逐年增加。截至目前，在Sciencedirect(http://www.science-direct.com)中输入 “DNA barcode”检索可得到1155篇文献。DNA条形码研究已成为不可逆转的趋势。

2 DNA条形码的研究进展

DNA条形码自提出以来，已在多个类群的研究中得到了应用。包括真菌 (Seifert et al.，2007)，植物(Kress et al.，2007)，纤毛虫(Chantangsi et al.，2007)，珊瑚 (Barber et al.，2006)，腹足类 (Remigio and Hebert，2003)，蜘蛛(Greenstone et al.，2005)，甲壳动物 (Costa et al.，2007)，昆虫 (Hebert et al.，2004a;Hajibabaei et al.，2006b;Burns et al.，2008;Kumar et al.，2007;Smith et al.，2008)，鱼类 (Ward et al.，2005)，两栖类 (Vences et al.，2005)，鸟类(Hebert et al.，2004b) 及灵长类 (Lorenz et al.，2005)等。国内也有学者开展了一些研究，如高玉石等 (2007)、屠云洁等 (2009)分别对6个地方和3个地方鸡的线粒体COⅠ基因多样性进行了研究，结果表明COⅠ基因对鸡品种的鉴定结果与形态鉴定基本相符。冯毅等 (2009)利用DNA条形码信息研制DNA芯片，成功鉴定了3种西花蓟马。彭居俐等 (2009)的研究表明以COⅠ基因作为鲌属鱼类DNA条形码进行物种鉴定具有一定的可行性。王中铎等 (2009)探讨了COⅠ条码序列在硬骨鱼类辅助物种鉴别的适用性。

传统形态学分类对于一些类群的鉴定非常耗时，缺乏可用的鉴定性状 (Huang et al.，2007;Evans et al.，2007)。相比之下，DNA条形码提供了一个快速、简便的鉴定系统 (Herbert et al.，2003a)。在一些生物多样性调查研究中，DNA条形码鉴定物种的准确率达到了97%(Janzen et al，2005) 或 97.9% (Hajibabaei et al.，2006b)。在鳞翅目等类群中，通过DNA条形码发现了大量隐存种或新种 (Herbert et al.，2004a;Monaghan et al.，2005):Vaglia等 (2008) 通过 DNA条形码在天蛾科Sphingidae)中发现的隐存种与形态学鉴定结果相一致;Silva-Brand˜ao等(2009)认为鳞翅目中出现如此多隐存种，跟动物相互之间通过模仿或拟态而造成的物种形成或分化有关，借助DNA条形码是很好的研究途径;Janzen等 (2009)通过DNA条形码研究哥斯达黎加瓜纳卡斯特省(ACG)的昆虫标本，发现该地区鳞翅目19个科中，有17个科的种类有所增加。

另外，DNA条形码能够从不同发育时期的动植物标本或分散的组织中鉴别出物种，例如对幼鱼的鉴定 (Pegg et al.，2006);Domingo-Roura等(2006)通过对一种名贵的修面刷所用材料进行DNA条形码分析，获知该产品是由欧亚獾Meles meles的毛所制成;Teletchea等 (2008)将DNA条形码用在对超市食品的检验上。DNA条形码也可用在对包含多种生物组合的环境样本如动物的粪便、水、土壤等的鉴定中，例如根据粪便中提取的线粒体DNA多态性，可以将在同一区域活动的阿穆尔豹Panthera pardus orientalis和西伯利亚虎Panthera tigris altaica区分开来 (Sugimoto et al.，2006)。

但有不少学者反对仅仅依靠DNA序列进行物种分类 (Will and Rubinoff，2004;Moritz and Cicero，2004;Will et al.，2005)。他们提出抛弃传统分类方法，会造成分类学的倒退，分类学有可能又回归到依据单一性状进行分类的类型学 (typology)时代;他们认为仅用DNA序列作为分类依据，会丧失很多有用信息，特别是颠覆了传统意义上的物种认知，使人们对物种的理解变成了抽象的代码。也有学者提出应该取消DNA分类的概念，认为DNA分类只是部分科学家的一厢情愿，并没有多少实际意义 (Köhler et al.，2007)。还有学者结合生态学、形态学、行为学等多种性状，进行物种的鉴定、发现与高级阶元的分类，即综合分类 (Integrated taxonomy) (Will et al.，2005)。实际上，无论是DNA分类还是DNA条形码，无论在理论上或实际应用中都不可能完全取代传统分类，但却可以从各种不同的角度和领域填补传统分类的不足或解决一些传统分类无法入手的难题。总之，DNA分类和DNA条形码研究仍然在飞速向前推进。

3 与DNA条形码有关的讨论

3.1 DNA条形码与DNA分类的关系

DNA条形码与DNA分类几乎同时提出，彼此虽然相互联系，但又有所不同 (Vogler et al.，2006;Hajibabaei et al.， 2007;DeSalle， 2005;DeSalle et al.，2007)。

目的不同:DNA条形码基于DNA序列之间的相似度进行物种鉴定，注重实效，而不是构建生命树 (the Tree of Life)或进行系统发育研究(Hajibabaei et al.，2007)。DNA条形码只作为物种鉴定的工具，并不单独作为物种分类的平台。相比之下，DNA分类则是要建立一个单独依靠DNA序列的分类系统 (Blaxter et al.，2005;Cognato et al.，2006;Vogler et al.，2007)。虽然DNA 分类结果也需要与林奈命名系统相对应，但根据Tautz(2003)的构想，DNA分类不依赖形态特征，能有效排除人为因素，基于DNA序列的分类更为客观，更接近物种的自然属性。DNA分类在为物种鉴定提供平台的同时，还需要进一步探讨物种的系统发育、高阶元分类地位等深层次的内容。

所用基因不完全相同:DNA条形码在提出之初，就强调用统一的基因序列进行鉴定，虽然研究者倡导在解决一些特殊类群，或处理一些特殊情况如假基因、基因交流等时，需要再加一条候补基因 (alternate loci/candidate loci) (Hajibabaei et al.，2007)。但目前动物类群中使用较多的仍是COⅠ基因。甚至在一些特殊领域 (如法医)中，标本的DNA已经降解，无法提取完整长度的COⅠ基因，提取的COⅠ基因短到200 bp～500 bp也可以准确鉴定物种 (Hajibabaei et al.，2006b)。植物的线粒体基因进化速率较慢，COⅠ基因无法有效区分物种，经过近几年的反复研究讨论，倾向于在叶绿体基因组中选取不同片段进行组合 (Chase et al.，2005;Kress et al.，2005)。

但在DNA分类中，对于长度仅为658 bp的COⅠ基因来讲，所包含的信息量并不足以很好的解决物种的系统发育等问题。特别是针对一些特殊类群，仅仅凭借COⅠ基因不具有强大的说服力。所以，要进行更深层次的分类工作，一般仍需要再加至少一条其它区域的DNA序列 (如核基因等)，甚至还需要附加其它的性状 (生态学、行为学等)来进行辅助研究 (Hajibabaei et al.，2007)。

分析方法不完全相同:虽然DNA条形码主要用系统发育分析常用的树来做分析，但仅仅是为了验证物种的单源性和聚类关系，通常要求所用分析方法简洁、快速，所以这些树并不能看做系统发育树。而DNA分类为了解决系统发育与高级阶元分类关系等问题，针对DNA序列的特点，可能要用到多种软件、多种算法构建系统发育树，运算耗时较长。

从某种程度上来讲，DNA条形码与DNA分类虽然目的不同，但也可相辅相成，DNA条形码计划可以为DNA分类提供大量可用数据，完全可以作为DNA分类系统的实践部分 (practical component)(Hajibabaei et al.，2007)。

3.2 物种概念的定义

近年来，有关物种概念的定义一直在争论之中。十九世纪之前，分类学家主要根据生物表型特征上的差异来识别和区分物种。随着现代综合进化论和群体遗传学的建立，Mayr(1963)提出了“生物学物种概念”(the biological species concept/BSC)，认为对于有性生殖生物而言，物种是一个具有共同基因库、与其它类群之间存在生殖隔离的类群。

但物种形成是一个渐进的过程，何时确定为新物种形成，有时在分类实践中难以操作。单从进化历史的一个截面上讨论物种问题，有其局限性 (Hennig，1966)。有学者认为物种形成是对不同自然环境或性选择的分化适应，生殖隔离是这种分化适应的副产物，而没有必要将整个基因组上完全的生殖隔离作为物种形成的绝对标准(Wu，2001)。

DNA条形码的研究不可避免会触及到物种定义的问题。Herbert(2004b)认为，种内种间的线粒体COⅠ基因差异存在一个阈值 (baocoding gap/threhold)，低于此阈值就可认为是同一个种，例如鳞翅目大约在3%左右 (Herbert et al.，2003a)。不少研究支持这一假设 (鸟类:Hebert et al.，2004b;鱼类:Ward et al.，2005;鳞翅目:Hajibabaei et al.，2006b)。但在实际研究中，许多类群存在种内种间线粒体基因序列差异重叠的现象，而且各类群、谱系之间的阈值也不相同。有学者认为种内种间差异更多的是经验法则，缺乏理论基础，很难成为适用于所有动物类群的标准值(Meyer and Paulay，2005;Hickerson et al.，2006;Wiemer and Fiedler et al.，2007;Townzen et al.，2008)。也有学者指出，物种的形成是一个动态的、连续的过程，单用种内种间差异来进行物种定义不能准确将其表达 (Rubinoff et al.，2006)。虽然传统概念上，生殖隔离的不同物种在DNA序列的差异比同一物种之间可能要大，但DNA序列的差异标准难以确定，是否针对各类群制定不一样的标准，仍需要进一步研究 (Vogler et al.，2006)。

物种定义是一个复杂的问题，虽然仅凭DNA条形码并不足以解决，但DNA条形码提出的种内种间差异阈值，及存在的种间基因流等现象可以为进一步修订物种定义提供参考。

3.3 DNA条形码面临的问题

3.3.1 进化速率

COⅠ基因在不同生物中的进化速率并不一致(Erpenbeck et al.，2006)，如果进化太慢，则难以鉴别物种。有研究表明，珊瑚虫线粒体DNA种间差异很小，难以区分物种 (Shearer et al.，2002)。在高等植物中，COⅠ基因并不适合物种鉴定(Kress et al.，2005;Chase et al.，2005;Pennisi，2007)。在这种情况下，需要增加其它候补基因。CBOL植物工作组 (CBOL Plant Working Group)提出在植物DNA条形码中利用两种基因rbcL和matK的组合来进行鉴定。而动物中，各个类群并不一致。对于候补基因的确定，目前并没有统一。

3.3.2 假基因现象

核内的线粒体基因拷贝 (即假基因NUMTs，Willams and Kowlton，2001;Silva-Brand˜ao et al.，2009)很容易用保守的通用引物与同源的线粒体基因同时扩增出来，由于假基因进化速率一般较小，所以会严重影响DNA条形码的准确性。虽然假基因可以鉴定 (Thalmann et al.，2004;Silva-Brand˜ao et al.，2009)，但仍然会有遗漏，且其存在不能预知，给研究带来了较大困难。目前有效避免扩增出假基因的技术正在不断完善，期待将来能够加以妥善解决。

3.3.3 种间线粒体基因交流

因为线粒体基因属于母系遗传，所以可能会出现一些导致错误鉴定的现象。比如:种间杂交和内共生体感染，杀雄微生物和细胞质不亲和共生菌 (如:沃尔巴克wolbachia)所导致的在线粒体基因上发生的间接选择 (Funk et al.，2000;Whitworth et al.，2007)。沃尔巴克是细胞内寄生、母系遗传的α-变形菌。约有17% ～76%的节肢动物被沃尔巴克感染，包括昆虫及蛛螨类。已有研究发现，沃尔巴克等内共生菌的存在，会造成寄主mtDNA多态性降低或提高，从而影响基于mtDNA的DNA条形码及系统发育研究。也有学者正在积极进行沃尔巴克共生菌的研究，期待能有效避免其对DNA条形码研究的影响。

另外，Funk和Omland(2003)在对2319个动物种类的研究中发现有23%的动物种类线粒体DNA呈多系 (polyphyly)或并系 (paraphyly)，另外还有发生在一个谱系中的网状进化等现象(Hulcr et al.，2007;Silva-Brand˜ao et al.，2009)，如果仅用线粒体DNA条形码来鉴定物种，可能会出现很多错误 (Meyer and Paulay，2005;Meier et al.，2006)。

3.3.4 取样的问题

一些浸泡标本给取样带来了困难。例如浸泡在福尔马林等溶液中的标本，无法提取DNA(Frézal et al.，2008)。还有一些个体很小的标本，如果用作DNA提取，将会完全破坏标本，或模式标本不复存在。对于后者，有研究设计出超声波降解法，从体长在毫米数量级的蚋科昆虫标本中成功地提取DNA(Mann et al.，2009)。但该方法仍然存在缺陷，由于PCR阻碍物的存在、DNA释放量不充足以及提取到的DNA片段被过度缩短等原因，并不是所有标本都可按照这种方法提取DNA和进行随后的DNA序列分析。

也有研究者提出，因为取样的范围过小和不均匀，才会出现种内种间有差异阈值的现象存在(Meyer and Paulay，2005)，如果增加地理种和近缘种的干扰，DNA条形码鉴定的准确率就会下降。所以取样时，尽可能包括同一种群的不同地理亚种，使DNA条形码数据库的覆盖面尽可能扩大，才能达到准确鉴定物种的目的。而且，目前对于DNA样品的收集和保存还没有一个统一的标准，保护这些具有潜在价值的DNA样品是一个亟待解决的问题。

3.3.5 分析方法

DNA条形码一般采用K-2-P(Kimura-2-parameter)模型计算种内种间距离。K2P是遗传距离值很小时的最佳模型 (Hebert et al.，2003a)，是生物条形码联盟 (CBOL)推荐使用的遗传距离计算模型 (barcoding.si.edu/)。也有少数研究采用多元尺度分析 (Multidimensional scaling，Herbert et al.，2003a)、似然 法 (Likelihood，Matz and Neilsen，2005) 或贝叶斯 (Nielsen and Matz，2006)等方法。

常用的系统发育分析方法有NJ(Neighbor-Joining)、UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic mean)、ML(Maximum Likelihood)、MP(Maximum Parsimony)、贝叶斯、Austerlitz等。第二次iBOL会议 (台北，2007年9月)对几种系统发育分析方法进行了比较，认为ML法比基于遗传距离的系统发育分析方法更准确，但ML法运算时间较长。此外，所有方法的精确性受取样范围和分类单元内变异程度所影响。Lahaye等 (2008)经过研究认为，MP法和UPGMA法得到的物种正确识别率最高，并在最新的论文中只用这两种方法。但目前DNA条形码研究使用较多的仍然是基于遗传距离的系统发育分析方法，如NJ法。在对大规模数据组进行分析时，NJ法速度较快，在物种序列同源性较高的情况下，NJ法的准确性是值得信任的。

一些研究者认为基于遗传距离的计算方法有缺陷，如种内种间差异经常发生重叠的问题，而这些缺陷可用基于多种性状的分析方法 (character-based approach) (DeSalle et al.，2005) 或纯粹基于分类算法的统计方法CAOS(characteristic attribute organization system) (Sarkar et al.，2002)加以解决。但这些方法目前仅在蜻蜓目 (Rach et al.，2008)、石鳖 (Kelly et al.，2007) 等类群中应用。其它计算方法还有最大似然法、BLAST等，但均未广泛应用。

4 DNA条形码计划在我国的进展

由CBOL主办的国际条形码会议已经举办了三届，我国均有代表与会。2008年4月，中国科学院代表团与iBOL签订了合作谅解备忘录，使我国成为iBOL四个中心节点之一，与加拿大、美国和欧盟具有同等地位。随后又成立了iBOL中国委员会，该委员会设立了南方和北方两个分中心，该委员会的主要宗旨在于加强我国与iBOL的合作，同时搭建中国DNA条形码数据库体系与协同工作平台并召开iBOL中国委员会会议，争取经费，合理配置人力资源，推动学科发展。

在中国科学院知识创新工程重要方向性项目的支持下，DNA条形码技术规程和规范体系已在准备和探讨，对不同类群的启动策略、数据库构建、人才队伍建设已有比较全面的设计。优先启动农林害虫、药用昆虫、媒介昆虫、传粉昆虫、外来入侵物种、重要保护动物等具有重要经济及理论价值的类群。中国DNA条形码的数据库平台，在iBOL中国委员会南方中心和北方中心的共同努力下已经建成，数据库的整体结构与加拿大的总库保持一致。

5 DNA条形码研究展望

不同物种的传统鉴定工作常常需要采用不同的方法和技术，而DNA条形码大大简化了这个程序，在一定程度上是一个较为通用的标准方法(Hajibabaei et al.，2007)。DNA条形码在各个领域与不同类群的研究中，所取得的成果有目共睹。针对DNA条形码可行性的争论似乎已经不再继续，科学家们目前正在各自领域争分夺秒地获取大量条形码数据，BOLD系统正以每年300万条序列，30万个样本的速度扩充。DNA条形码数据库不但可以为鉴定物种服务，同时获取的大量资源可为系统发育学、种群遗传学等学科提供有用信息。iBOL是一个庞大的工程，取样、证据标本、DNA提取都需要大量资金和人力，需要各国分类学、生态学等专家的通力合作才能完成。为了能尽快检验DNA条形码的准确性和便捷性，及早建立一个完整类群的条形码数据库是非常必要的。DNA条形码的特点和优势，使DNA条形码在生物多样性调查研究、保护生物学、有害生物控制、流行病传染源检测、法医、食品工业及检验检疫等领域都将有广阔的应用前景。

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