TLC和HPLC法相结合分析盐水鸭中的生物胺

王凤芹，刘 芳，孟 勇，王道营，诸永志，徐为民,*

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.农业部渔业产品质量监督检验测试中心(南京)，江苏 南京 210017)

TLC和HPLC法相结合分析盐水鸭中的生物胺

王凤芹1，刘 芳1，孟 勇2，王道营1，诸永志1，徐为民1,*

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.农业部渔业产品质量监督检验测试中心(南京)，江苏 南京 210017)

应用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)两种方法分析盐水鸭中生物胺的组成及含量。薄层层析结果显示，盐水鸭样品中存在着腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、酪胺和2-苯乙胺；利用高效液相色谱法也检测到了以上6种生物胺，且各生物胺的含量均在204μg/g以下。两种方法结果相吻合，TLC法可以作为肉制品中生物胺定性分析的一种经济便捷的方法。

盐水鸭；生物胺；薄层层析(TLC)；高效液相色谱(HPLC)

生物胺是一类低分子质量的含氮化合物，通常存在于动植物体及食品中，主要有组胺、腐胺、尸胺、色胺、精胺、亚精胺、酪胺及2-苯乙胺8种。食品中的生物胺主要通过具有脱羧酶活性的微生物的脱羧作用形成，当以食品为介质被人体过量摄入后，会引起一系列不良症状[1]。对食品中生物胺的含量进行检测，确定生物胺来源的具体微生物，将为产品的安全控制提供重要的理论基础。

盐水鸭独特的感官特性决定其熟化和杀菌温度不能超过90℃[2]，因此产品中必然残存些微生物。这些残存的微生物不仅使得盐水鸭腐败变质[3]，也可能产生多种胺类物质。目前食品中生物胺的研究多集中在发酵类肉制品上[4]，而有关低温禽肉制品中生物胺的研究报道较少。本实验采用薄层层析(TLC)与高效液相色谱(HPLC)相结合，定性定量分析盐水鸭中生物胺的组成及含量，从而为预防和控制生物胺的形成和累积提供重要的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐水鸭样品于2010年8月购自南京某盐水鸭专卖店。随机取2只，托盘包装后于冰盒中携至实验室(2h内)，置4℃冰箱16h后取腿、腹、背、翅及颈肉，剪碎混合作为样品。

色胺(Try)、2-苯乙胺(Phe)、腐胺(Put)、尸胺(Cad)、组胺(His)、酪胺(Tyr)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)标准品 美国Sigma公司；衍生剂丹酰氯 日本TCI公司；乙腈、丙酮(色谱纯)；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2695型高效液相色谱系统 美国Waters公司； Utleaturrax T25匀浆器 德国IKA公司；台式高速冷冻离心机 德国Herolab公司；JS-680C全自动凝胶成像分析仪上海培清科技有限公司。

1.3 TLC法实验方法

1.3.1 标准溶液的配制[5]

用50g/L三氯乙酸(TCA)配成5.0mg/mL的各生物胺标准储备液；用储备液配制各单标的质量浓度为50μg/mL，混合标准溶液质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20μg/mL。

1.3.2 样品处理[6]

取10g样品，加入20mL 50g/L的TCA，匀浆，18℃，3000r/min离心10min，沉淀用2×10mL 50g/L TCA洗涤，收集3次上清液，定容到50mL，0.22μm有机膜过滤，避光冷藏。

1.3.3 衍生[7]

取5mL滤液和1mL标液，用3×2mL乙醚洗涤，弃去醚相，沸水浴蒸干水相；加1mL饱和NaHCO3溶液和丹酰氯(5mg/mL溶剂为丙酮)，塞紧混匀，40℃水浴避光反应1h，加0.5mL 0.1g/mL甘氨酸(除去残留丹酰氯)混合，塞子打开(挥发丙酮)，40℃避光反应20min；加3mL水，用3×2mL乙醚洗涤，收集3次醚相；待乙醚挥发完毕，加入1mL乙酸乙酯，置冰箱保存待检。

1.3.4 展开及显色

展开剂组分为氯仿、乙醚、三乙胺，体积比依次为4∶1∶1、8∶1∶2和4∶0∶1；展开前加入25mL预饱和30min，通过分离效果确定最佳配比[5]。

点样台点样，样量2μL，间隔1.5cm，待样点干燥后，置入展开槽内，待展开剂扩展到距样点17cm处取出，通风厨内干燥，自动凝胶成像分析系统紫外灯下显色，拍照。

1.4 HPLC法实验方法

1.4.1 标准溶液的配制

准确称取色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺各50mg，用0.4mol/L的高氯酸(HClO4)定容到50mL，配成1mg/mL储备液备用。分别取以上标准品储备液，用0.4mol/L HClO4配制成质量浓度分别为2.5、5.0、10.0、25.0、50、100μg/mL的混合标准溶液，铝箔避光、4℃冰箱保存备用。

1.4.2 样品处理

取10g待测样品加入20mL 0.4mol/L HClO4匀浆，冷冻离心机4℃，2500r/min离心10min，沉淀部分如上述方法再提取一次，收集两次上清液用0.4mol/L HClO4定容到50mL，0.22μm有机膜过滤，避光冷藏[8]。

1.4.3 标准溶液及样品的衍生化

分别取上述1mL标准及样品溶液，加入200μL 2mol/L NaOH溶液使之呈碱性，然后加入300μL的饱和NaHCO3溶液进行缓冲，再加入2mL丹酰氯溶液(10mg/mL丙酮为溶剂)，混匀，置于40℃水浴避光反应30min，结束后加入100μL的氨水中止反应，去除残留的丹酰氯，最后用乙腈定容到5mL。检测前用0.22μm的有机滤膜过滤。

1.4.4 色谱分析

采用液相色谱系统，色谱柱为C18柱，紫外检测波长为254nm，流速为1mL/min，流动相A为水，B为乙腈，采用梯度洗脱程序，进样量20μL。

2 结果与分析

2.1 TLC法对盐水鸭中生物胺的分析检测结果

为了获得较好的分离效果，本实验选取4∶1∶1、8∶1∶2和4∶0∶1三个不同体积比的展开剂，结果发现当氯仿、乙醚、三乙胺配比为4∶1∶1时，各生物胺拖尾较严重，分离效果不好；而当配比为4∶0∶1时，展开剂极性太强，各生物胺分布比较集中，分离效果同样不佳；当配比为8∶1∶2时，解决了上述问题，分离效果较好。

图1 不同质量浓度的生物胺混合标样的TLC检测结果Fig.1 TLC patterns of mixed biogenic amine standards at different concentrations

图1是8种生物胺标样6个质量浓度梯度的TLC分析结果，点样量为2μL。当混标中各生物胺的质量浓度为0.5μg/mL时，腐胺斑点亮度最强，但亮度随着质量浓度增加变化不明显；尸胺及亚精胺有微弱斑点，其他生物胺未检出。质量浓度为1μg/mL时，除检出前三种生物胺外，还检出精胺，并且亮度随着质量浓度增加而增加，其他生物胺未检出。质量浓度为2μg/mL时，共6种生物胺被检出，除前4种生物胺外新检出组胺及酪胺；质量浓度为5μg/mL时，共7种生物胺检出，新检出苯乙胺；质量浓度为20μg/mL时，色胺被检出，此时8种生物胺全部被检出。由上分析得出8种生物胺检出次序为腐胺、尸胺及亚精胺、精胺、组胺及酪胺、苯乙胺和色胺；表明TLC对腐胺的检测限值最低，尸胺及亚精胺次之，色胺最高；可见TLC对生物胺的检出限会因胺物质的种类不同而有所差异，这与Shalaby等[7]的研究结果基本一致。

图2 标样及样品中生物胺的TLC分析结果Fig.2 TLC patterns of single biogenic standards (50μg/mL) and samples

图2是标样及样品中生物胺的检测结果，其中泳道1到6分别是各个生物胺标准样品，而泳道7和8对应两个样品。在该分离条件下，6种标样获得了相对较好的分离效果；同时，发现在酪胺对应的泳道上有两个点，这与Costantini等[9]的实验结果一致。样品中由于酪胺的含量较低，其低点未能检测出；由图2可见，从两个盐水鸭样品中分别都检测到6种生物胺，按分离次序，从下到上依次为腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、酪胺和2-苯乙胺；但在水平方向上与样品中斑点存在微小差异，这可能与样品中杂质较多，分子间发生作用有关。样品1中腐胺对应的斑点较样品2的亮度大，表明样品1中腐胺含量多于样品2，这与HPLC的检测结果一致，HPLC检测到样品1中腐胺含量为11.85μg/g，而样品2中未检出；这表明TLC法对腐胺检测限值较低，与上述结果吻合；同理，对于尸胺的分析，样品1较样品2中斑点亮度大，而HPLC对两样品的检测值分别为55.20μg/g和14.90μg/g，两种方法结果吻合；而亚精胺、精胺、酪胺及2-苯乙胺由于含量差别不大，斑点亮度几乎一致；这表明TLC分析结果可靠度较高，可在样品进行HPLC分析之前，先用TLC进行定性分析。

2.2 HPLC法对盐水鸭中生物胺的分析检测结果

图3 生物胺混标的标准色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of mixed biogenic amine standards

如图3所示，在实验选取的色谱条件下，各生物胺能有效分离，且峰形对称，没有拖尾等现象，因此可以采用此条件对样品中的生物胺进行分析。图4、5是样品1和样品2中生物胺的检测结果，表1所示的是样品中各生物胺的含量。各生物胺的含量均在204μg/g以下，从样品1中依次检测出2-苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺、精胺及亚精胺共6种生物胺；其中亚精胺的含量最大，达203.72μg/g，腐胺的含量最小为11.15μg/g；从样品2中依次检测出2-苯乙胺、尸胺、酪胺、精胺及亚精胺等共5种生物胺，其中亚精胺的含量最大达200.67μg/g，酪胺的含量最小为11.27μg/g，腐胺未检出。

图4 样品1的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of sample 1

图5 样品2的HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of sample 2

表1 样品中各生物胺的含量Table 1 Contents of biogenic amines in samples 1 and 2

3 讨 论

利用TLC与HPLC法均从盐水鸭样品中检测到了酪胺、腐胺、精胺、尸胺、2-苯乙胺及亚精胺共6种生物胺，并且研究发现TLC对各种生物胺的检测限值较低，故TLC可以作为一种便捷、经济的定性分析食品中生物胺的方法。

托盘包装盐水鸭在4℃冰箱贮藏16h后，由于加工及贮藏过程中污染的微生物的生长，使得产品中生成了多种生物胺。由于污染的微生物种类和数量不同，盐水鸭样品中存在的生物胺种类及含量可能存在差异。两个样品均未检出色胺与组胺，表明该样品在加工和贮藏过程中，未污染具有色氨酸和组氨酸这两种脱羧酶活性的微生物。前人研究发现不同菌株在产生生物胺的种类及含量上存在着较大差异，等[10]研究发现肠杆菌科主要产腐胺、尸胺、酪胺和组胺，其中弗氏柠檬酸杆菌属产酪胺能力最强，此外乳杆菌中的一些菌株也呈酪胺阳性；Rivas等[11]研究了从高压处理过的西班牙香肠chorizo中分离出来的200株乳酸菌和葡萄球菌在冷藏过程中的生物胺产生情况，结果发现产生的最主要的生物胺为2-苯乙胺，其次为酪胺。在乳酸菌中，酪胺的产生主要与弯曲乳杆菌有关，而多数弯曲乳杆菌也是产生2-苯乙胺的阳性菌株；而在葡萄球菌中，肉糖葡萄球菌产2-苯乙胺或同时产2-苯乙胺和酪胺；阴沟肠杆菌和沙门氏亚种产腐胺和尸胺能力较强[12]。 Komprda等[13]在研究发酵剂对香肠中生物胺含量的影响中发现，精胺源于原料肉，且含量不会受到菌种的影响，因此推断盐水鸭样品中较高浓度的亚精胺及精胺可能来源于鸭肉本身。

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[3]LI Yanliang, YAO Dongrui, WANG Daoying, et al. Sensory, physicochemical and microbiological changes in water-cooked salted duck during storage at 4 ℃[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Science, 2010, 23(7)∶ 960-964.

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[6]SHAKILA R J, VASUNDHARA T S, KUMUDAVALLY K V. A comparison of the TLC-densitometry and HPLC method for the determination of biogenic amines in fish and fishery products[J]. Food Chemistry, 2001, 75(2)∶ 255-259.

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Biogenic Amines in Salted Duck Analyzed by TLC Combined with HPLC

WANG Feng-qin1，LIU Fang1，MENG Yong2，WANG Dao-ying1，ZHU Yong-zhi1，XU Wei-min1,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；2. Quality Supervision and Testing Center for Fishery Products (Nanjing), Ministry of Agriculture, Nanjing 210017, China)

The composition and contents of biogenic amines in salted duck were analyzed by thin layer chromatography (TLC) combined with high performance liquid chromatography (HPLC). Six biogenic amines including putrescine, cadaverine, spermidine, spermine, tyramine and 2-phenylethylamine were detected in salted duck samples by TLC. Similarly, six biogenic amines were also detected by HPLC, and the concentration of each biogenic amine was less than 204μg/g. The analytical results obtained by both methods were consistent. Therefore, TLC can be used as an economic and rapid method for the qualitative analysis of biogenic amines in meat products.

salted duck；biogenic amines；thin layer chromatography (TLC)；high performance liquid chromatography (HPLC)

TS251.68

A

1002-6630(2011)14-0273-04

2010-10-25

江苏省自然科学基金项目(BK2010469)；江苏省农业自主创新基金项目(CX(10)440)

王凤芹(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为食品质量安全。E-mail：lfklds@yahoo.com.cn

*通信作者：徐为民(1969—)，男，研究员，博士，研究方向为食品加工与质量控制。E-mail：weiminxu2002@yahoo.com.cn