高效液相色谱法同时检测酱油中7种防腐剂

夏 静，张敬轩，李 挥，杨 岚，吴春敏

(河北省食品质量监督检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北省 石家庄 050051)

高效液相色谱法同时检测酱油中7种防腐剂

夏 静，张敬轩，李 挥*，杨 岚，吴春敏

(河北省食品质量监督检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北省 石家庄 050051)

建立利用高效液相色谱法同时测定调味品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸及对羟基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯7种防腐剂的方法。该方法中酱油样品经Oasis HLB柱进行固相萃取净化后用Warters-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙酸铵-乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱，并在230、260nm波长处检测，结果在0.4～100mg/L的线性范围内测得7种物质的线性相关系数均大于0.9994，方法检出限介于0.28～0.55mg/L之间，各个组分的回收率范围在84.4%～102.3%之间。该方法可以应用于测定这7种物质在酱油中的含量。

酱油；高效液相色谱；防腐剂

我国目前酱油行业中，使用量最大的防腐剂主要是苯甲酸及其盐类，且GB 2760—2007《食品添加剂使用卫生标准》中规定其最大添加量为0.1%[1]，FAO/ WTO(1984年)规定，ADI值为0～5mg/(kg·d)[2]。随着人们对食品的安全性、功能性、营养性的饮食理念不断提高，国民对于食品防腐剂的安全性也提出了更高的要求。越来越多类别的食品添加剂被用到调味品的防腐处理中，其中以对羟基苯甲酸酯类[3]和乳酸链球菌素(Nisin)[4]和脱氢乙酸[5]等安全、低毒、高效的新型防腐剂居多。针对这种形势的发展，也给检测工作者提出了更高的要求。国家标准及大部分的文献中规定了食品中苯甲酸盐类及山梨酸盐类采用的是高效液相色谱法进行测定[6-12]，对羟基苯甲酸酯类则多采用气相色谱法测定[13]，而且所测样品主要集中于化妆品类，脱氢乙酸也可采用高效液相色谱法进行测定[14-15]，鉴于国标方法已能够满足日常检验的需要，但为了提高本实验室检验能力和检验效率，需要找到一种可以同时测定多种防腐剂的方法。高效液相色谱法同时具备分离效率高、灵敏度高和重现性好等优点，因此，应是目前进行上述物质分析的首选方法。此外，酱油中含有大量的蛋白质、色素及脂肪，不仅影响样品的提取，而且会造成液相色谱分离时色谱柱的堵塞，因此采取固相萃取对样品进行净化[10]。本实验采用反相高效液相色谱法同时测定7种防腐剂，利用二极管阵列检测器提供的被测组分的光谱扫描图和其相应保留时间综合定性鉴别，提高定性的准确性，旨在为酱油中7种防腐剂的测定提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱油样品：市场抽检、石家庄市珍极酿造厂提供酱油阴性样品。

甲醇、乙腈(均为色谱纯) 迪马公司；乙酸铵(优级纯)、冰乙酸(分析纯)、磷酸(分析纯)、磷酸二氢钾(分析纯)；标准品(均为色谱纯)：苯甲酸、山梨酸 德国DR公司；脱氢乙酸 美国Sigma公司；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯 Dikma(中国)公司。

1.0 mg/mL苯甲酸、山梨酸标准储备液；1.0mg/mL脱氢乙酸标准储备液；1.0mg/mL对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯标准储备液。

1.2 仪器与设备

1200超快速液相色谱仪[内附自动进样器、二元泵、二极管阵列检测器(DAD)]、固相萃取装置 美国Agilent公司；RT15T高速冷冻离心机 上海天美公司；AE 200万分之一分析天平 法国Mettler公司；KQ-250pv超声波清洗器；移液器(1、5mL)；Oasis HLB固相萃取柱(500mg，6mL) 美国Waters公司。

1.3 色谱条件

色谱柱：Warters-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。流动相A为乙酸铵(20mmol/L，并调pH值至4.0)，流动相B为乙腈。采用梯度洗脱程序详见表1。流速：1.00mL/min；进样体积：10μL；温度：30℃；检测波长：230、260nm。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

1.4 标准曲线方程的确定

将标准溶液分别稀释为10、20、40、50、80、100μg/mL，并在上述色谱条件下测定，后得到各自的标准曲线方程。

1.5 样品前处理及固相萃取

选取10个有代表性的酱油样品：取1mL酱油样品于10mL刻度离心管中，加5mL水，用氨水(1+9)调节pH7，用水定容至10mL，超声提取30min，15000r/min离心10min，上清液经0.22μm水相滤膜过滤后，供净化使用。

固相萃取：取固相萃取小柱加3mL甲醇活化，再加3mL水进行平衡，然后取处理后的样品清液5.0mL，以1.0mL/min流速通过萃取柱，用3mL 5%甲醇-0.1%磷酸溶液清洗萃取柱，弃去清洗液。最后用1.5mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，用水定容至5.0mL，用0.45μm针头过滤器过滤，10μL进样分析。

2 结果与分析

2.1 色谱柱和流动相洗脱条件的选择

实验采用两种色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm，5μm)和Warters-C18(4.6mm×250mm，5μm)进行，通过比较其分离效果和出峰时间，最终选定后者。

采用乙酸铵和乙腈作为流动相，分别在不同质量浓度配比、不同pH值、不同梯度洗脱的各种条件下考察了各种因素对于目标化合物的分离度及峰形的影响。最终采用了表1中的洗脱程序。在该条件下分离7种质量浓度均为100mg/L的混合标准品色谱图见图1。

图1 7种标品在质量浓度为100mg/L时的分离色谱图Fig.1 Chromatogram of 7 preservative standards at the concentration of 100 mg/mL

2.2 不同组分最大吸收波长的确定和检测波长的选择

二极管阵列检测器最突出的特点即是可提供被测组分的光谱扫描图，在色谱过程中可同时收集被测组分的光谱信息和色谱信息，这为对于不同化合物的准确定性提供了极大的方便。因此本实验将混合标准溶液进行全光谱范围内的扫描，根据光谱图得到了各组分的最大吸收波长分别为：苯甲酸224nm、山梨酸253nm、脱氢乙酸231nm，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯均为260nm。最终选定苯甲酸，山梨酸及脱氢乙酸的检测波长为230nm；对羟基苯甲酸酯类的检测波长为260nm。

2.3 固相萃取柱和洗脱溶剂的选择

酱油中含有大量的酱色和蛋白质，会造成液相色谱分离时色谱柱的堵塞，因此在进行液相色谱分离前，必须进行处理以保护色谱柱，保证检测工作顺利进行。本实验采用固相萃取对酱油样品进行净化，并对固相萃取柱的种类和洗脱溶剂进行选择。

2.3.1 固相萃取柱的选择

酱油提取后的溶液体积较大且含有的杂质较多，需要进行净化和浓缩富集。实验比较在试样中添加质量浓度均为5.0mg/L的标准物质，按照1.5节操作，平行3次实验，通过平均回收率比较中性氧化铝柱、C18柱和HLB柱3种固相萃取柱的净化效果，结果表明，HLB的净化效果最佳，见表2。

2.3.2 洗脱溶剂的选择

表2 试样固相萃取净化回收率实验结果汇总表(n=3)Table 2 Effect of SPE column type on average spike recoveries of 7 preservatives (n=3)

实验采用HLB柱对酱油样品进行净化，并对洗脱溶剂进行考察。在5.0mg/L添加量，按照1.5节操作，平行3次实验，对比实验结果。1)接取直接流过液，用水定容至5mL，测定其含量；2)接取甲醇洗脱液，用水定容至5mL，测定其含量；3)接取20%甲醇洗脱液，用水定容至5mL，测定其含量见表3。可见，用甲醇洗脱时，7种被测物均可得到很好的洗脱。

2.4 标准曲线的绘制

分别移取标准储备液进行逐级稀释，并配制成一系列质量浓度的标准混合液，在所选定的色谱条件下，以峰面积对质量浓度绘制成标准曲线。方法的检出限以RSN=3计算。各组分标准曲线的线性方程、相关系数及检出限见表4。在0.4～100mg/L范围内，线性相关系数均大于0.9994，方法检出限介于0.28～0.55mg/L之间。

表3 不同洗脱溶剂对回收率的影响(n=3)Table 3 Effect of elution solvent type on average spike recoveries of 7 preservatives (n=3)

表4 方法线性方程、检出限和RSD (n=6)Table 4 Linear equations, detection limits, and relative standard deviations (n=6)

2.5 精密度和回收率实验

表5 加标回收率实验结果Table 5 Average recoveries of 7 preservatives from a blank sample at 3 spike levels

取同一空白样品平行试样7份，分别添加3个水平的等量混合标准溶液，按1.5节处理进行回收率实验，每个水平重复操作3次，所得的回收率及精密度见表5，各个组分的回收率范围在84.4%～102.3%之间，7种防腐剂的平均回收率为89.9%～96.5%、RSD为4.1%～6.1%，此结果令人满意。

2.6 实际样品的测定

采用本方法对日常监管任务的样品进行测定，结果显示不同厂家生产的酱油样品中以配制酱油中添加防腐剂种类较多，同时在酿造酱油中也有检出。本实验提到的7种防腐剂都有检测出阳性样品。研究表明过量摄入防腐剂会对人体内分泌系统造成危害[16]。

3 结 论

此法采用二极管阵列-反相高效液相色谱实现同时检测酱油中苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸酯类(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯)7种物质。DAD检测器既能提供各组分物质的色谱图也能提供光谱图，保证准确鉴别各物质。且测量的范围可以满足酱油中防腐剂的检测需求，同时针对不同的食品，也可以通过改变前处理方法实现对于各种食品中防腐剂的测定。该方法具有针对大批样品的检测工作有极大的优势，且简单易操作，结果准确可靠。另外，由于实验安排也考虑到生物防腐剂的影响，但并未有实质性的结果，在今后的研究工作中可将重点转向此类防腐剂与其他多种防腐剂的同时检测。

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Simultaneous Determination of 7 Preservatives in Soy Sauce by High Performance Liquid Chromatography

XIA Jing，ZHANG Jing-xuan，LI Hui*，YANG Lan，WU Chun-min
(Key Laboratory of Food Safety of Hebei, Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050051, China)

An analytical method to simultaneously determine 7 preservatives in soy sauce such as benzoic acid, sorbic acid, dehydroacetic acid and p-hydroxybenzoic acid esters (methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben and butyl paraben) was established using high performance liquid chromatography. The analytes were cleaned up on Oasis HLB column and detected at 230 nm and 260 nm. Their chromatographic separation was performed on Warters-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5μm) using acetonitrile and ammonium acetate as mobile phase for gradient elution. All the 7 preservatives displayed a linear concentrationpeak area relationship over the concentration range of 0.4-100 mg/L, with a correlation coefficient of larger than 0.9994. The limits of detection of the method were from 0.28 to 0.55μg/mL. Average spike recovery rates for the 7 preservatives in a blank sample were from 84.4% to 102.3% (n = 3). This method can be used to detect preservatives in soy sauce rapidly and conveniently. Key words：soy sauce；high performance liquid chromatography(HPLC)；preservatives

TS202.3；TS264.21

A

1002-6630(2011)14-0219-04

2010-09-24

河北省质量技术监督局科技项目(090107)

夏静(1981—)，女，工程师，硕士，研究方向为食品添加剂的检测技术。E-mail：xiajing0508@163.com

*通信作者：李挥(1978—)，男，工程师，博士研究生，研究方向为仪器分析。E-mail：lihui7171@163.com