人工虫草多糖对小鼠CCl4肝损伤的保护作用

2011-04-01 01:40陆艳艳邱细敏刘湘军朱剑波
食品科学 2011年7期
关键词:冬虫夏草菌丝体残基

陆艳艳,邱细敏*,刘湘军,朱剑波,冯 星,张 瑜

(湖南师范大学医学院药学系,湖南 长沙 410006)

人工虫草多糖对小鼠CCl4肝损伤的保护作用

陆艳艳,邱细敏*,刘湘军,朱剑波,冯 星,张 瑜

(湖南师范大学医学院药学系,湖南 长沙 410006)

目的:研究人工虫草不同部位多糖及固体培养残基多糖对小鼠CCl4肝损伤的保护作用。方法:取健康的雄性小鼠60只,按体质量随机分成6组:正常对照组、急性CCl4肝损伤模型组、虫草子实体多糖组、菌丝体多糖组、固体培养残基多糖组和阳性药物组,每组10只。用紫外分光光度法测定比较血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量,测定肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总蛋白(TP)含量,并对肝细胞的组织形态学进行观察。结果:虫草多糖子实体、菌丝体和固体培养残基多糖组,能显著抑制CCl4引起的小鼠血清ALT、AST活性及肝脏MDA含量的升高,以及肝脏SOD含量的降低,并能显著减轻CCl4引起的肝小叶内的灶性坏死。结论:虫草多糖子实体、菌丝体和固体培养残基多糖组对小鼠化学性肝损伤具有保护作用,人工虫草子实体多糖效果最优,其次为菌丝体多糖,再次为固体培养残基多糖。

人工冬虫夏草;子实体;菌丝体;固体培养残基;多糖;肝损伤

肝损伤是严重威胁人类健康的世界性疾病。肝损伤分为化学性肝损伤和病理性肝损伤。化学性肝损伤主要是由于过敏、化学药物中毒等引起,比如酒精、药物、有机农药中毒等都会引起肝损伤、肝功能异常。据了解,目前有上千种西药会造成肝损伤。肝病在我国具有较高的发病率,且发病年龄偏低,起病隐袭,病程迁延,常发展为不可逆转的肝硬化,并发肝性脑病、上消化道出血、顽固性腹水,反复发作,严重危害到病人的生命安全。肝损伤是慢性肝炎向肝硬化发展的必经途径,具有可逆转、持续时间长的特点。如果能得到有效治疗,则可延缓或防止肝病的发展。因而肝损伤防治具有极其重要的临床意义。我国传统的中医药在肝病的防治领域具有独特的优势。已有一些中药被临床和实验研究证实具有抗损伤的作用,其中虫草是受到广泛关注的一种,但其确切的作用机制尚不完全清楚。本研究复制小鼠CCl4肝损伤模型,并给予虫草多糖干预,以观察其对这一病变过程的阻断作用。为预防或延缓肝病的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清洁级小鼠:雄性,体质量(20±2)g,SCXK(湘2006-0001),由湖南长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供。

人工冬虫夏草(2005年产品通过ISO9001:2000质量管理体系认证;获得美国FDA认证,证书号2121209)湖南益康高科技生物有限公司;护肝片 黑龙江葵花药业集团医药有限公司;冰醋酸、四氯化碳、甲醛 国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇 长沙湘科精细化工厂;谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

UV-2501紫外分光光度计、AUY 120电子分析天平日本岛津公司;5451C离心机 德国Eppendorf公司;冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 虫草多糖提取

分别取人工冬虫夏草干品的子实体、菌丝体及固体培养残基适量,粉碎称质量,加无水乙醚于圆底烧瓶中,连续回流脱脂,过滤风干后的药渣用8倍量沸水回流提取3次,分别以10、6、6倍体积的沸水,各提取2、1、1h,合并上清液[1],经浓缩后,75%乙醇溶液沉淀、Sevag法脱蛋白、蒸馏水透析72h,无水乙醇洗涤3次后,经冷冻干燥后得虫草精多糖。临用时分别配制成50mg/mL虫草子实体、菌丝体、固体培养残基多糖-生理盐水溶液[2]。

1.3.2 动物分组及给药

将清洁级小鼠 60只,随机分为6组:正常对照组(饲喂正常饲料)、急性CCl4肝损伤模型组(简称模型对照组,正常饲料+CCl4)、虫草子实体多糖组(正常饲料+CCl4+500mg/kg多糖)、虫草菌丝体多糖组(正常饲料+CCl4+500mg/kg多糖)、虫草固体培养残基多糖组(正常饲料+CCl4+500mg/kg多糖)和阳性药物组(护肝片溶液100mg/kg),每组各10只[3]。每天晚上7:00,虫草子实体多糖组、菌丝体多糖组、固体培养残基多糖组分别以相应多糖溶液灌胃0.2mL,阳性药物组以10mg/mL护肝片-生理盐水溶液灌胃0.2mL,正常对照组与模型对照组灌胃等体积0.2mL生理盐水,连续灌胃7d,末次灌胃2h后,正常对照组注射0.2mL花生油,其他各组每只鼠腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液0.2mL[4-5]。

1.3.3 样品采集

末次给药后,禁食16h,断头取血约3mL,室温放置2h,3000r/min离心10min后取血清,-20℃密封保存备用;取肝左叶用生理盐水制成10%的组织匀浆。取肝右叶,用10%甲醛溶液固定,冰冻保存。

1.4 指标检测

1.4.1 血清指标测定

严格按照试剂盒操作说明书,采用赖氏法测定AST与ALT活力[6]。

1.4.2 肝匀浆中MDA指标测定

按照试剂盒操作说明书,采用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量[7]。

1.4.3 肝脏SOD和TP测定

按照试剂盒操作说明书,取肝匀浆,用考马斯亮蓝法测定组织中蛋白含量,采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性[8-10]。

1.4.4 肝组织病理变化

取甲醛固定的肝右叶组织,常规石蜡切片,HE染色、20×10倍光镜镜检[11-13]。

1.4.5 数据处理方法

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理。采用方差分析和t检验,所有数据都以x±s表示。实验过程中60只大鼠,模型对照组死亡1只,其余各组均为10只。

2 结果与分析

2.1 人工虫草多糖对小鼠血清ALT和AST的影响

表1 虫草多糖对CCl4肝损伤小鼠血清ALT和AST活性影响Table 1 Effect of polysaccharides from different parts of Cordyceps sinensis on the activities of serum ALT and AST in mice with CCl4-induced liver damage

由表1可知,模型对照组的AST、ALT水平显著高于正常对照组(P<0.01),说明肝细胞已受到破坏。阳性药物组和不同部位多糖中AST、ALT水平显著低于模型对照组(P<0.01),表明治疗组起到了抑制AST、ALT升高的作用[14]。子实体、菌丝体、固体培养残基多糖组同阳性药物组比较有显著性差异(P>0.05),说明人工虫草不同部位多糖同阳性药物组都对肝细胞损伤疗效相当,且子实体多糖疗效高于护肝药。各多糖治疗组间比较,子实体多糖疗效略高于菌丝体多糖,二者效果均高于固体培养残基多糖。

2.2 人工虫草多糖对小鼠肝匀浆SOD活性、TP及MDA含量的影响

表2 虫草多糖对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆SOD活性、MDA和TP含量的影响Table 2 Effect of polysaccharides from different parts of Cordyceps sinensis on SOD activity as well as MDA and TP contents in liver of mice with CCl4-induced liver damage

由表2可见,模型对照组SOD水平显著低于正常对照组(P<0.01),说明肝细胞已受到破坏。阳性药物组、菌丝体、子实体和固体培养残基多糖组SOD水平显著高于模型对照组(P<0.01),表明阳性药物与虫草多糖治疗组起到了抑制SOD降低的作用。各治疗组总蛋白与模型对照组比较,无明显差异(P>0.05),推测可能因造模时间太短,总蛋白的变化没有充分表现出来。

模型对照组MDA含量显著高于正常对照组(P<0.01),说明CCl4诱导的急性肝损伤模型成功。阳性药物组、菌丝体、子实体和固体培养残基多糖组MDA水平显著低于模型对照组(P<0.01),表明阳性药物与虫草多糖治疗组起到了抑制MDA升高的作用。

2.3 组织形态学观察

制作肝脏病理切片,进行光镜观察,见图1。正常对照组:细胞形态规则,排列整齐,肝小叶结构清晰。模型对照组:肝细胞索紊乱,肝细胞广泛坏死,坏死灶分布于肝小叶中央静脉周围和肝被膜下,肝细胞变性,周围有空泡,脂肪性变严重,大量炎症细胞浸润。与血清AST、ALT升高结果一致。虫草子实体多糖组:肝细胞损伤明显减轻,肝细胞呈不同程度脂肪变性、水肿,坏死灶不明显。虫草菌丝体多糖组:肝小叶中央静脉周围有少量肝细胞轻度坏死,坏死灶明显减少,偶见散在点状分布,水肿不明显。虫草固体培养残基多糖组:可见肝细胞中度及重度脂肪变性,以小叶中心较为明显,可见点、灶性坏死。阳性药物组:肝细胞轻度脂变,少量炎细胞侵润,呈点状坏死,水肿不明显。可见虫草子实体、菌丝体和固体培养残基多糖组对CCl4肝损伤小鼠肝细胞的坏死均具有显著的保护作用,但3组之间区别不大,未见明显差异。

图1 各组肝细胞组织形态学观察(HE染色,20×10)Fig.1 Morphology of liver cells from normal group, model group with CCl4-induced liver damage, fruitbody polysaccharide group, mycelium polysaccharide group, solid culture residue polysaccharide group, positive control group (HE, 20×10)

3 讨 论

CCl4是一种常用的化学性肝损伤诱导剂,进入体内后,被肝脏中的微粒体细胞色素氧化酶(P-450)激活产生活泼的三氯甲基,该自由基易与肝细胞微粒体、溶酶体、内织网的脂蛋白膜结合产生脂质过氧化作用,导致小鼠ALT、AST、MDA水平升高,SOD水平降低[15]。小鼠CCl4肝损伤模型易于操作、耗时短、费用低廉,因此选定此模型进行实验。

ALT和AST是反映线粒体膜损伤和肝细胞损伤的重要指标。正常情况下血清ALT活性很低,当肝细胞受损时,其细胞膜通透性增大,促进ALT的释放;AST主要分布在线粒体内,当线粒体膜受损时,血清中的AST含量会升高[16]。人工虫草不同部位多糖可降低血清ALT、AST的含量,与模型组比较有显著差异,说明虫草多糖对肝细胞和线粒体膜有保护作用,且子实体多糖疗效高于菌丝体,固体培养残基多糖次之。

MDA含量变化可反映肝细胞损伤程度[17],SOD是细胞内重要的抗氧化酶。虫草多糖通过抑制细胞膜脂质过氧化物MDA的含量降低,增强SOD的活性,促使肝细胞的抗氧化能力增强,从而抵御肝细胞过氧化和氧应激,使肝细胞避免受损,达到治疗肝损伤的目的。当肝细胞受损时,蛋白合成会受阻,但本实验蛋白受阻现象不明显,有待进一步实验研究。

目前人工冬虫夏草药用部位主要采用子实体,本实验针对工业生产中的副产物菌丝体未能充分利用,固体培养残基更是作为废料处理的浪费现象(约97%的固体培养残基,直接排放掉,不仅造成环境污染,而且浪费虫草资源),以人工冬虫夏草为样本,通过文献[17-18]和实验确证不同部位虫草多糖的含量和结构存在差别,本实验通过研究不同部位虫草多糖对小鼠肝损伤的保护作用,旨在为进一步开发利用人工冬虫夏草资源提供有价值的参考。

综上所述:虫草多糖子实体、菌丝体和固体培养残基多糖组,能显著抑制CCl4引起的小鼠血清ALT、AST活性及肝脏MDA含量的升高,以及肝脏SOD含量的降低,并能显著减轻CCl4引起的肝小叶内的灶性坏死,对肝损伤产生显著保护作用。人工虫草固体培养残基、菌丝体多糖与阳性药物疗效差异不大,且略低于子实体多糖的疗效,因此从本实验反应出人工虫草固体培养残基和菌丝体在药理方面有被利用的价值。

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Protective Effect of Polysaccharides from Different Parts of Cultured Cordyceps sinensis on CCl4-induced Liver Damage in Mice

LU Yan-yan,QIU Xi-min*,LIU Xiang-jun,ZHU Jian-bo,FENG Xing,ZHANG Yu
(Department of Pharmacy, Medical College of Hunan Normal University, Changsha 410006, China)

Objective: To explore the protective function of polysaccharides from different parts (fruitbodies, mycelia and residual solid medium) of cultured Cordyceps sinensis on carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver damage in mice. Methods: Totally 60 healthy male mice with the body weight of (20 ± 2) g were randomly divided into 6 groups: control group, acute CCl4hepatic injury model group, sporophore polysaccharide group, mycelium polysaccharide group, solid culture residue polysaccharide group and positive control group with 10 mice in each group. The activities of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and total protein (TP) were determined. The morphology of liver tissues was examined. Results: An obvious inhibition effect of polysaccharides from fruitbodies, mycelia and residual solid medium of Cordyceps sinensis on the increases of AST and ALT activities in serum and MDA in liver was observed. In contrast, the polysaccharides from the three sources could decrease SOD activity in liver and ameliorate local necrosis in liver. Conclusion: The three polysaccharides from Cordyceps sinensis have an obvious protective effect against chemical-induced liver damage. Fruitbody polysaccharides are superior to mycelium polysaccharides.

cultured Cordyceps sinensis;solid culture residue;mycelium;fruitbody;polysaccharide;liver injury

TS218

A

1002-6630(2011)07-0319-04

2010-09-02

湖南省教育厅重点项目(10A071);国家大学生创新性实验项目(043-0094)

陆艳艳(1985—),女,硕士研究生,主要从事中草药分离分析研究。E-mail:weixiaopast99@126.com

*通信作者:邱细敏(1954—),女,教授,本科,主要从事中药材分离分析研究。E-mail:qiuximin@tom.com

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