芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及生物信息学分析

许 伟，仇 明，余晓红，封功能，邵 荣

(盐城工学院化学与生物工程学院，江苏 盐城 224051)

芽孢杆菌植酸酶基因的克隆及生物信息学分析

许 伟，仇 明，余晓红，封功能，邵 荣

(盐城工学院化学与生物工程学院，江苏 盐城 224051)

采用PCR技术从Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中克隆到植酸酶的全长基因phyC(1152bp)，并将该基因成功克隆到表达载体pET22b(+)，经PCR鉴定和DNA测序证明，pET22b(+)-phyC重组质粒构建成功。将该酶的氨基酸序列在Swiss-prot数据中进行BLAST比对发现，该序列未见报道，其与来自Bacillus subtilis的植酸酶序列(Swiss-prot ID: O31097)最相似，序列一致性为98.7%。分析可知该氨基酸序列在位点为128、144、153、257和370处分别变异为Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。运用SignalP 3.0服务器对其信号肽进行预测，表明该酶N端1～26个残基可能是信号肽序列。运用SWISS-MODEL服务器进行同源建模，经PROCHECK V3.5软件对其Ramachandran plot、G-factor等进行评价，结果显示结构模型中的键长、键角及二面角的分布及结构合理。该基因已在GenBank上登录(登录号为HM747163)。

植酸酶基因；克隆；同源建模

植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myo-inositol hexaphoshate phosphohydrotase)是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或者磷酸盐)这类酶的总称[1]。它是一种新型、绿色环保的饲料用酶，对于提高饲料中磷的利用率，提高机体对蛋白质及多种微量元素的利用率及减轻因动物高磷粪便所导致的环境污染有着极其重要的意义。然而，目前对于植酸酶制剂的研发主要集中在酸性植酸酶上，仅适合胃中pH值呈酸性的单胃动物以及少数鱼类如虹鳟等，不适用于我国水产养殖量最大的消化道为中性的鲤科鱼类。来源于芽孢杆菌的植酸酶属于中性植酸酶，其可在pH值为中性的肠道中起作用，有效弥补了传统酸性植酸酶的不足，拓宽了植酸酶的应用范围[2-3]。由于野生微生物菌株的产酶水平较低，制约了中性植酸酶在生产上的广泛应用，因此提高菌株植酸酶的产酶水平是实现其产业化应用的关键[4-5]。

当前，国内外关于中性植酸酶的研究主要集中于产酶菌筛选和基因工程菌的构建方面[6-8]。2001年中国农业科学院饲料研究所和生物技术研究所合作，从枯草芽孢杆菌中提取中性植酸酶，获得初步成功[9]。姚斌等[10]进一步对此菌株进行了克隆并在大肠杆菌中表达。Kim等[11]用带有诱导型T7启动子的pET22b(+)质粒，在大肠杆菌中经IPTG诱导3h，表达量为出发菌株的50倍，并证明乳糖是工业发酵生产植酸酶的诱导剂。陈艳等[12]将来源于淀粉液化芽孢杆菌的植酸酶在大肠杆菌中进行了表达，结果发现：重组酶最适pH值为7.5，最适温度为70℃，植酸钠为底物的Km值为0.32mmol/L，单位发酵液工程菌的植酸酶活性为出发菌株的1.27倍。李朝霞等[13]从自然界中筛选到高产中性植酸酶的地衣芽孢杆菌，并对其产酶的培养条件进行了研究。目前已分离出多种产中性植酸酶的微生物主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌及其他菌株等[14]。研究人员运用基因工程手段在植酸酶热稳定性改造方面也进行了较多的研究[15-17]。本实验从Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061的中克隆到新的植酸酶基因，并对其进行同源建模及分析，以期为中性植酸酶的结构与功能关系研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061) 德国DSMZ菌种保藏中心；表达载体质粒pET22b (＋)、E.coil DH5α为实验室保存。

1.2 试剂

限制性内切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker (DL2000) 日本Takara公司；Ready-to-easy PCR反应试剂盒、快速连接试剂盒、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、EZ-10质粒提取试剂盒及氨苄青霉素 生工生物工程(上海)有限公司。

1.3 培养基

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，完全溶解于950mL去离子水中，以5mmol/L的NaOH溶液调节pH7.0，定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。基因工程菌在培养前加入氨苄青霉素至终质量浓度100μg/mL。LB固体培养基即在液体培养基中加入2%的琼脂粉。

1.4 方法

1.4.1 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061的培养

装有30mL LB液体培养基锥形瓶(250mL)，经高温蒸汽灭菌(121℃，20min)并冷却，按接种量体积分数1%接种300μL已经活化的菌种至培养基中，置摇床中培养。培养条件为温度30℃，转速150～160r/min，培养过夜。

1.4.2 分子克隆操作方法

DNA酶切、连接、转化和细菌感受态制备等基本基因操作技术参照文献[18]及有关公司提供的操作手册进行。采用CaCl2法制备E. coli DH5α的感受态细胞，采用42℃热休克方法进行转化。取对数期B. amyloliquefaciens DSM 1061细胞，采用改良的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA[18]。采用生工生物工程(上海)有限公司的胶回收试剂盒将目的基因片段进行纯化，并运用质粒提取试剂盒抽提质粒。

1.4.3 植酸酶基因phyC的扩增及表达质粒的构建

参考GenBank报道的Bacillus amyloliquefaciens植酸酶基因(AY055220)，采用Primer Premier 5.0 设计引物。在引物中分别引入限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ(加粗下划线部分)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物如下：phyC-F：5＇-GCGGATCCATGAATCATTC AAAAACAC-3＇，phyC-R：5＇-GTCAAGCTTTTAT TTTCCGCTTCTGTC-3＇。

以提取的基因组为模板，采用生工生物工程公司的PCR试剂盒进行扩增。PCR的反应参数为：94℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；共进行36个循环。扩增产物采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

将PCR产物和pET22b(+)载体分别用BamHⅠ和HindⅢ消化并连接，构建质粒pET22b(+)-phyC。连接液转化DH5α细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定，提取质粒并送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.4.4 植酸酶序列的生物信息学分析

蛋白质序列比对及分析采用软件ClustalX 1.83和Vector NTI 8.0，三维结构显示使用Rasmol 2.7[19]和DeepView3.7软件。运用蛋白质组服务器(http://expasy. org/tools/)中的Signal P 3.0工具对其信号肽进行预测，选用其中的神经网络方法，预测范围设置为革兰氏阳性菌，N-端70个氨基酸残基；对删除信号肽部分的中性植酸酶(353氨基酸残基)运用SWISS-MODEL服务器进行同源建模，采用晶体结构(PDB ID: 2POO)为模板[20]；运用软件PROCHECK V3.5对同源模型的Ramachandran plot、G-factor进行分析，并运用PDBsum数据库中的二级结构分析模块(secondary structure)对模型的二级结构进行分析。以上软件中参数设置非特殊说明均采用软件默认值。

2 结果与分析

2.1 中性植酸酶基因的克隆及表达质粒的构建

以B.amyloliquefaciens DSM 1061基因组DNA为模板，加入合成好的引物进行PCR反应扩增目的基因。PCR的扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果见图1。PCR产物为单一条带约为1.1kbp，对应片段大小与预期相符合。将PCR产物和pET22b(＋)载体分别用BamHⅠ和HindⅢ消化并连接，构建了重组质粒pET22b(＋)-phyC(图2)。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α。然后挑选阳性克隆并提取质粒DNA，PCR鉴定表明基因phyC已准确地克隆到pET22b(＋)表达载体。

图1 植酸酶基因(phyC)PCR扩增产物Fig.1 Agarose gel electrophoregram of PCR products of phyC

图2 重组表达质粒pET22b(+)-phyC构建图谱Fig.2 Physical map of recombinant expression plasmid pET22b(+)-phyC

2.2 植酸酶基因phyC的DNA测序及其生物信息学分析

2.2.1 植酸酶氨基酸序列的比对分析

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLASTp将所克隆的植酸酶翻译的蛋白质序列与蛋白质数据库中的序列比对，发现其与来自Bacillus subtilis (Swiss-prot ID: O31097 )的植酸酶序列最相似，序列一致性为98.7%。运用Vector NTI 8.0软件对所克隆到的中性植酸酶与O31097进行比对分析，结果见表1。研究所获得的植酸酶序列其在氨基酸残基位点为128、144、153、257和370处分别变异为Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。

表1 获得的植酸酶与来自B. subtilis (Swiss-prot ID: O31097 )的残基差异Table 1 Different residues of the phytase compared with those of B. subtilis

2.2.2 植酸酶信号肽预测

图3 神经网络方法预测植酸酶信号肽结果Fig.3 Prediction of signal peptides of phytase based on neural networks

运用Signal P 3.0对已经获得的中性植酸酶从N端开始的70个氨基酸残基进行信号肽分析(图3)，其中在蛋白质序列的N端1～26个氨基酸残基的S值较高，说明该部分可能是中性植酸酶的信号肽序列。其中，在26位和27位左右Y值和C值达到最高，预测信号肽剪切位点在SQA-KH，在N端26位后进行剪切，其中27位可能是成熟蛋白质部分。

2.2.3 植酸酶同源建模与评价

图4 植酸酶同源建模结构及突变残基(a)植酸酶的同源模型(b)残基突变的空间位置Fig.4 Mutation position and homology structure of phytase (a) homology structure of phytase (b) The position of mutant residues

运用SWISS-MODEL服务器(http://swissmodel. expasy.org/)，对删除信号肽部分的中性植酸酶(353个氨基酸残基)进行同源建模。服务器基于序列相似性对建模模板进行筛选，采用与实验中获得的植酸酶序列相似性为93.768%并且来自于Bacillus amyloliquefaciens的植酸酶晶体结构为模板(PDB ID:2POO，分辨率为2.05A)。通过去除HET基团，对初始比对序列进行精加工，进行简单骨架分配、加侧链、加氢等过程对模型进行构建，经结构与能量优化后最终模型总能量为-17062.795kJ/mol (图4a)。图4b中标出了该酶与B. subtilis (Swiss-prot ID: O31097 )相比，变异残基在空间结构中的位置。

图5 植酸酶同源模型的Ramachandran图Fig.5 Ramachandran plot of homology structure of phytase

图6 植酸酶同源模型的二级结构分析Fig.6 Secondary structure of homology structure of phytase

运用PROCHECK V3.5对同源模型的Ramachandran plot、G-factor进行分析。图5根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定哪些成对双面角(φ和ψ)所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以φ为横坐标，以ψ为纵坐标作图。在进行同源建模的353个氨基酸残基中，除Gly和Pro以外的300个氨基酸残基，有249个处于最许可区域，占83%；有50个处于额外许可区域，占16.7%；有1个处于普遍许可区域(在图中标注的Asp27)，占0.3%。在这300个残基中没有位于不许可区域的，其中位于最许可区和额外许可区的占99.7%，说明模型的主链和侧链结构合理。运用PROCHECK检查植酸酶的同源模型得到二面角和主链共价作用力的G-factors平均值分别为-0.24和0.35，说明模型的各项指标在对应的统计学范围内。

运用PDBsum工具中的二级结构分析模块对植酸酶同源模型的二级结构进行分析，结果如图6所示。植酸酶模型二级结构由7个片层、17个β发夹，20个β突起，27条β链、7个螺旋，36个β转角，4个γ转角组成。

3 结 论

中性植酸酶作为一种新型绿色饲料添加剂，在推广应用上具有极其广阔的空间。本研究运用基因工程技术获得了B. amyloliquefaciens DSM1061植酸酶的全长基因phyC，经Swiss-prot数据中进行BLAST比对可知该酶为新型的中性植酸酶(GenBank：HM747163)。将该基因成功构建到大肠杆菌表达质粒pET22b(+)上，目前课题组正在开展相关的表达及蛋白纯化工作。

本研究所获得的中性植酸酶氨基酸序列与来自B. subtilis的植酸酶序列(Swiss-prot ID: O31097)最相似，序列一致性为98.7%，其在氨基酸位点为128、144、153、257和370处分别变异为Ala、Ile、Ser、Pro和Lys。蛋白质一级结构是蛋白质空间结构的差异性及生物功能的多样性的基础，推测以上5个氨基酸残基位点的变异，有可能会导致该酶具有与已经报道的中性植酸酶不同的性质及催化特点。同时，与其他中性植酸酶类似，本研究中获得的植酸酶的N端1～26个残基可能是信号肽序列，获得的中性植酸酶进行了同源建模及评价，结果显示结构模型中的键长、键角及二面角的分布及结构合理。研究结果进一步丰富了中性植酸酶的序列及结构信息，为进一步深入理解中性植酸酶结构与功能的关系提供参考，同时也为中性植酸酶的高效表达及开发应用提供参考。

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Gene Cloning and Bioinformatics Analysis of Phytase from Bacillus amyloliquefaciens

XU Wei，QIU Ming，YU Xiao-hong，FENG Gong-neng，SHAO Rong
(College of Chemical and Biological Engineering, Yancheng Institute of Technology, Yancheng 224051, China)

The full-length DNA sequence of neutral phytase gene was cloned from Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 by PCR, and successfully inserted into the expression vector pET22b(+). The results were identified by PCR and DNA sequencing. Based on Blast alignment, it was found that the amino acid sequence of the enzyme has never been reported the Swiss-prot database. Its amino acids sequence showed 98.7% identity with that of Bacillus subtilis (Swiss-prot ID: O31097). The residues 128, 144, 153, 257 and 370 are replaced by Ala, Ile, Ser, Pro and Lys, respectively. The N-terminal residues 1—26 were predicted to be a signal peptide by Signal P 3.0 Server. The homology modeling of the new phytase was constructed using SWISSMODEL. The software PROCHECK V3.5 was used to evaluate the model according to Ramachandran plot and G-factor. The results showed that the bond length, bond angle, the distribution of dihedral angle and structure were rational. The gene sequence has been submitted to the NCBI GenBank and the accession number is HM 747163.

phytase gene；cloning；homology modeling

Q812

A

1002-6630(2011)07-0202-05

2010-08-04

江苏省普通高校自然科学研究资助项目(09KJB530011)

许伟(1976—)，女，副教授，博士，研究方向为酶工程。E-mail：ycitxuwei@ycit.edu.cn