鱼类MSTN基因的研究进展

邵芳，卢祥云，顾志良

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

鱼类MSTN基因的研究进展

邵芳，卢祥云，顾志良

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

肌肉生长抑制素（MSTN）属于转化生长因子超家族，是主要在骨骼肌中特异性表达且功能比较专一的肌肉发育负调控因子.鱼类的MSTN基因比较复杂，具有不同的同源基因.本文综述了鱼类MSTN基因的结构、种类、时空表达特征，MSTN的作用机理及生物学功能，鱼类MSTN基因多态性研究以及MSTN基因在鱼类生产中潜在的应用前景.

肌肉生长抑制素；同源基因；多态性

鱼类在脊椎动物中是种属数量最占优势的类群，物种众多，分布广泛，起源复杂[1].鱼类肌肉的生长、分化是其生长发育过程中的重要环节，受环境、基因和激素水平的调控等多种因素的影响.在基因水平上，与肌肉生长发育及分化有关的基因主要是作为正向调控因子的生肌决定因子（Myogenic regulatory factors，MRFs）和作为负向调控因子的肌肉抑制素基因（Myostatin，MSTN）.肌肉生长抑制素属于转化生长因子超家族，是近年来发现的作为主要在骨骼肌中特异性表达且功能比较专一的肌肉发育负调控因子，它通过抑制生肌调节因子（MyoD）家族成员转录活性负向控制肌细胞的生长发育，它的表达量与肌肉重量的变化呈负相关[2].在家畜中，MSTN基因的活性丧失可导致肌肉增大，体重增加，因此有关MSTN基因的研究近几年来一直是十分活跃的研究领域，并已取得了显著的进展.在鱼类MSTN的研究中，对重要养殖鱼类进行遗传改造以控制MSTN基因的表达或生物活性，无疑会给水产养殖业带来巨大的影响.

1 鱼类MSTN基因的结构、种类和表达

1.1 鱼类MSTN基因的结构和种类

自从MSTN基因在小鼠中被发现以来，由于具有潜在的应用价值，越来越多物种的MSTN基因被鉴定，鱼类的研究也很多.目前已经在斑马鱼（Danio rerio）、虹鳟鱼（Oncorhychus mykiss）[3-6]等鱼中克隆到了MSTN基因.对这些鱼类MSTN基因的研究中可以看出，鱼类MSTN均是由3个外显子和2个内含子组成，外显子编码分泌性的N-端信号序列，具有高度的种间多样性，外显子2和外显子3高度保守，编码前肽和C-端二聚体.不同物种外显子长度相差不大，但是内含子长度却是有很大差异，可能由于物种在长期选择进化过程中，内含子不同长度的缺失造成.尽管MSTN基因的内含子在不同鱼类中有较大的差别，但都显示了保守的内含子-外显子边界，符合GT-AG规则[7].澳洲肺鱼MSTN-1上游的顺式调控成分包括TATA-box和E-Box，在其5’侧翼区具有较高的突变率，发现几个SNP位点.在3-UTR区发现一个microRNA的靶位点[8].

鱼类MSTN基因表达类型明显不同于哺乳类动物.Tovah等在斑马鱼中系统地分析了MSTN基因亚家族，在这个家族中发现了MSTN基因的表达差异，斑马鱼中存在MSTN-1和MSTN-2，两个基因序列比较发现一些明显差异[6].至今在多种鱼类中发现了MSTN基因的亚家族，如鲤鱼、虹鳟鱼有4个基因组成（MSTN1a, MSTN1b,MSTN2a,MSTN2b）.与此同时在石首鱼、绿河豚、虹鳟鱼、大西洋鲑鱼、罗非鱼等鱼中都获得了2 种MSTN基因，而且发现两者的同源性较高，虹鳟的两个基因序列之间的相似性高达94%[5]，鲑鱼的两种基因之间也具有93%的相似性[9].不过在有些鱼类如斑马鱼、鲤鱼、大西洋鲑和东方红鳍鲀中，其MSTN-1和MSTN-2的同源性在61.21%-64.91%，差异较大，可能是在这些鱼种MSTN基因重复的发生较早，造成两个基因在进化中产生较大差异[10].

研究发现两种基因在不同鱼类中表达存在差异，金头鲷MSTN-1在肌肉等多种组织中表达，而MSTN-2 mRNA仅在脑中表达[10,11].在斑马鱼发育过程的研究中发现，MSTN-1表达存在整个胚胎生成期，而MSTN-2的表达局限在体节形成早期阶段，这表明MSTN-2与骨骼肌的增长和发育是密切相关的，并且成年斑马鱼在遭受环境压力的过程中MSTN-1和MSTN-2在多种组织中表达[12].鱼类两个不同MSTN基因的差异表达可能是基因复制的结果[13].Oldham IM等也认为两个基因型的出现与进化过程中基因组倍增事件相关[14].

Mcpherron等人以小鼠保守的C-末端cDNA为探针对不同物种的骨骼肌cDNA进行筛选，克隆了人、猪、鼠、牛、斑马鱼等物种的cDNA序列，对MSTN基因序列分析表明：MSTN基因在不同物种间十分保守，而斑马鱼的MSTN基因序列保守性稍差，与上述其它物种的同源性为88%[6].MSTN基因在生物活性区表现出更高的保守性，从侧面反映了该基因受到了高度的进化限制和其功能的重要性.

1.2 鱼类MSTN基因的时空表达

MSTN基因的表达随着生物体的发育而发生变化，最初MSTN被认为只存在于骨骼肌中，具有组织特异性，而在其它组织中不存在，但最近的很多研究表明MSTN mRNA和蛋白也存在其它少数特定组织中.鱼类和哺乳类、鸟类MSTN基因的组织表达存在差异，鱼类MSTN除在骨骼肌表达外，还在多个组织中表达如肝、心、胃、腮、肾、肌肉、脑等.尽管不同物种的表达谱存在差异，但在肌肉中都检测到了较高的表达.如在泥鳅MSTN的组织RT-PCR检测结果MSTN基因在肌肉中强烈表达，在眼组织中微弱表达，其它所检测的组织中未见表达[9]；斑马鱼MSTN可以在骨骼肌、肝、心、胃、鳃、卵巢、精巢、肾、眼和脑等所检测的组织中表达[15]；银头鲷稚鱼发育过程中，可以在皮肤、脑、肌肉、咽、鳃、胰和肝中检测到MSTN，变形后还可以在食管、胃、肠、肾中检测到[5]；采用半定量RT-PCR方法，检测到MSTN基因mRNA在松江鲈肌肉、脑、肠和肝脏等不同组织的表达情况，发现在肌肉中MSTN mRNA表达量最高，肠组织中表达量次之，脑中有微量表达，肝脏中有痕量表达[16]；鱤MSTN基因在骨骼肌和脑中表达量较高，在心肌中也有较高表达，在肾脏、肠、鳃和肝脏中未见表达[17]；作者在对赤眼鳟MSTN基因组织表达分布检测时，发现在肌肉、脑、脾脏、肾和鳃组织中检测到MSTN基因的表达，在肌肉和脑中表达量较高，鳃组织表达较弱，脾脏和肾脏痕量表达，其它组织未发现明显表达（未发表资料）.MSTN的广泛分布及不同类型的存在表明，鱼类中的MSTN除了参加肌肉的生长和发育调控外，还可能参与其它组织和细胞的发育[18].

2 MSTN的作用机理及生物学功能

2.1 MSTN的作用机理

MSTN作为TGF-β家族成员，其作用通过使细胞周期停留在G1期而抑制多种类型的哺乳动物细胞的细胞周期进程.MSTN基因通过阻断细胞周期的G1和G2/M期来抑制成肌细胞的生长，影响成肌细胞在细胞周期中的分配比例，使G1和G2/M期细胞数量增加，而S期细胞数量显著减少.这种阻止是由许多细胞周期机制中的因子介导的，G1和S期进程受多级周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶（Cdks）共同调控，激酶活性又受Cdk抑制剂抑制[19].用MSTN处理成肌细胞发现，其可特异性上调p21的表达量，减少和降低了Cdk2的表达量和活性.此外还观察到Rb蛋白磷酸化减少，推测MSTN是通过使Rb蛋白去磷酸化、p21使cyclin-E和Cdk2失活，使成肌细胞生长阻止于G1期.

2.2 MSTN基因信号转导途径

目前公认的MSTN的信号传导途径是MSTN-ActRⅡB型受体（蛋白激酶受体）-Smad蛋白信号传导通路.其中涉及3类Smad蛋白：受体激活型Smad蛋白-Smad3、协同型Smad蛋白-Smad4和抑制型Smad蛋白-Smad7.MSTN与质膜上的受体蛋白结合后，使Smad2/3磷酸化激活，接着与Smad4形成复合体，进入细胞核与基因的调控序列结合促进或抑制相应基因的转录.但Smad2/3，Smad4复合体和Smad7调控序列上的SBE（Smad结合因子）结合后，促进Smad7的表达；而Smad7抑制Smad2/3磷酸化、Smad2/3与Smad4形成复合体，抑制MSTN诱导的转录，形成负反馈调节[2].

2.3 MSTN的基因表达调控

肌肉发育过程中及出生后其MSTN基因表达受到与肌肉发生有关因子的转译调控.研究发现来自小鼠、牛、猪和人约1.6Kb的启动子序列能上调MSTN基因的表达，说明肌肉专一性的基因转译与一些DNA序列相关，它们在这些物种是保守的.常见的肌肉专一性转译因子是E-box与MRFs：如MyoD、Myf5、Myogenin 等.Rios等发现MSTN过度表达可下调MyoD、MyoG的mRNA水平.降低MSTN的表达，则可以提高MyoD、MyoG的转录，而对IGF-1和Myf5没有影响[20].Sharrna等研究发现在牛的肌肉发育过程中，MSTN的表达时间与MyoD基本一致，并且两者在快肌中都有优势表达[6]，因此MyoD可能是肌肉发育过程中成肌细胞增殖分化时调节MSTN表达的一个主要调控因子.

2.4 MSTN基因的生物学功能

McPherron等通过基因敲除技术构建了MSTN基因突变纯合体小鼠，不仅可以存活还能正常生育，体重与野生型相比增加30%，骨骼肌纤维数量明显增加，且不受性别与年龄的限制[3]，MSTN表现的调控作用主要有2种形式：调控肌细胞增生或者肌细胞肥大.这一结果在斑马鱼MSTN基因灭活的实验中也得到了验证：MSTN基因灭活的斑马鱼比对照组体重增加了45%[12].目前世界著名的比利时蓝牛和皮埃蒙特牛，就是由于MSTN基因突变而出现双肌现象[21].

鱼类MSTN基因虽然表达分布广泛，但其基本功能仍然与肌肉的发育相关.为了研究MSTN基因在鱼类肌肉发育和生长中的作用，Xu等利用肌肉特异性启动子获得了在骨骼肌中过量表达MSTN功能前区的转基因斑马鱼，结果表明MSTN功能前区对MSTN功能有抑制作用[22].表达MSTN功能前区的转基因斑马鱼对生肌基因的表达、胚胎阶段快慢肌细胞的分化未显示明显的影响，肌纤维的大小也没有明显的不同，然而骨骼肌纤维的数目却明显增加，因此可得知鱼类MSTN在生肌过程和肌肉生长中起着重要的抑制作用.用反义的Morpholinos抑制斑马鱼MSTN的表达后，受精后20h，处理的胚胎生长快、个体大，体节数目多、体节长度和宽度增加[14].这些研究结果说明鱼类MSTN基因的主要功能与哺乳动物相似，对生肌过程和肌肉生长发育起着重要的抑制作用.

MSTN缺失或基因突变还会对脂肪的沉积起抑制作用.Alexandra等研究发现，MSTN基因突变纯合体小鼠的脂肪量比对照组平均少70%[23].在对野生型和肥胖型小鼠进行药理学实验说明MSTN基因决定脂肪的生成方向但不决定其分化[3].最新研究结果表明MSTN通过PPARγ和c/EBPα的表达水平来抑制前脂肪细胞的分化.并且MSTN可以显著激活两种油脂代谢速率限制酶的磷酸化[24].鱼类MSTN基因在多种组织中广泛分布间接证实鱼类MSTN功能可能并不局限于对肌细胞生长的抑制，在其他组织细胞及代谢途径中也能发挥相应的生物学功能.

3 鱼类MSTN基因多态性研究

许多研究表明，MSTN基因在动物进化过程中较保守，但目前在多种鱼类MSTN基因中发现微卫星序列和一些SNP位点.薛良义等在眼斑石首鱼MSTN基因内含子Ⅰ和3’-UTR区内分别发现了（TC）4CC（TC）4CT（TC）4和（AC）7微卫星序列[25]；在大黄鱼MSTN基因的3’-UTR中存在非完美型的微卫星序列（CA）30TA （CA）26

[26]；金头鲷MSTN基因的内含子Ⅱ和3’-UTR区内都存在（AC）n重复序列[27]；石鼓鱼MSTN基因序列的3’-UTR区存在（AC）29微卫星序列[28]；斑点叉尾鮰的MSTN基因序列内包含着多种微卫星序列：外显子Ⅰ内一段（CAG）6重复序列编码连续的谷氨酸，内含子Ⅰ内包含（GTTT）n、（TG）n和（TA）n三种重复序列，内含子Ⅱ内存在（GAA）n重复序列，3’-UTR内存在（AC）n重复序列[29]；松江鲈MSTN基因内含子Ⅱ中发现（AC）14的微卫星序列[6].Kocabas等人在对鲶鱼ORF的测序中发现了多个SNP位点，这些位点多数是中性突变，并不导致氨基酸的改变[29].澳洲肺鱼MSTN-1基因5’侧翼区具有较高的突变率，发现几个SNP位点[8].Nadjar-Boger等发现金头鲷的MSTN-2基因5-侧翼启动子区和内含子I存在变异，都有3个等位基因[11].这些结果说明鱼类MSTN基因内存在微卫星序列和SNP位点是比较普遍的.这些微卫星序列和SNP位点的发现可能作为鱼类肌肉生长性状相关的一个非常有用的分子标记，用于筛选对生产有利的突变，促进渔业生产.

4 MSTN基因在鱼类生产中的应用前景及展望

MSTN作为肌肉生长的抑制基因，是肌肉生长的负调控因子，其结构、表达调控和遗传变异的研究不仅加深人们对肌肉分化、发育和生长机制的了解，并且具有广泛的应用前景.目前MSTN基因在鱼类应用研究的前景和主要方向是：筛选MSTN基因的抗体或抑制剂，使之与MSTN基因表达蛋白结合从而降低或灭活其功能，利用此途径开发安全可靠的鱼饲料添加剂；利用MSTN分子标记技术结合传统的数量育种选培肉质性状优良的鱼类；利用基因同源重组技术（基因敲除技术）获得MSTN基因缺失的鱼类；在鱼培养细胞中进行MSTN基因的敲除或者人工突变，用MSTN基因改变的细胞作为供体进行核移植，生产MSTN基因修饰的鱼，这种鱼将具有肌肉生产量大、脂肪含量少的优良特点；利用RNAi技术干扰MSTN mRNA的表达，从而解除或缓解MSTN基因对肌肉细胞的抑制作用.结合体细胞基因敲除、RNA干扰、反义核酸和转基因技术，探索提高现有鱼类肌肉重量和质量具有可能性，也适于对一些地方品种进行改良.总之，在鱼类养殖上对MSTN基因的深入研究是必要的，今后该基因的开发和应用将会有更为广阔的前景.

[1]袁娟，张其中，罗芬.鱼类线粒体DNA及其在分子群体遗传研究中的应用[J].生态科学，2008，27（4）：272-276.

[2]Zhu X,Topouzis S,Liang L F.Myostatin signaling through Smad2,Smad3 and Smad4 is regulated by the inhibitory Smad7 by a negative feed back mechanism[J].Cytokine,2004,26（6）:262-272.

[3]McPherron AC,Lee S.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94.

[4]Rescan PY,Jutel I,Ralliere C.Two myostatin genes are differentially expressed in mytomal muscles of the trout（Oncorhynchus mykiss）[J].J Expri Biol,2001,204（20）:3523-3529.

[5]Ostbye T K,Gallowa y T F,Nielsen C,et a1.The two myostatin genes of Atlantic salmon（Salmo salar）are expressed in a varity of tissues[J].Eur Jbiochem,2001,268（20）:5249-5257.

[6]Tovah Kerr,Eric H Roalson,Buel D Rodgers.Phylogenetic analysis of the myostatin gene sub-family and the differential expression of a novel member in zebrafish[J].Evolution&Development,2005,7（5）:90-400.

[7]邵芳，费晓燕，卢祥云，等.松江鲈Myostatin基因内含子和线粒体D-loopDNA序列分析[J].常熟理工学院学报，2011，25（2）.

[8]De Santis C,Evans BS,Smith-Keune C,et al.Molecular characterization,tissue expression and sequence variability of the barramundi（Lates calcarifer）myostatin gene[J].BMC Genomics,2008,9:82-96.

[9]彭扣，陈伟伟，胡炜，等.泥鳅肌肉生长抑制素基因片段的克隆及其表达[J].水产学报，2007，31（2）：145-151.

[10]Maccatrozzo L,Bargelloni L,Radaell I G,et al.Characterization of the myostatin gene in the gilt head seabream（Sparus aurata）: sequence,genomic structure,and expression pattern[J].Mar Biotechnol,2001,3（3）:224-230.

[11]Nadjar-Boger E,Funkenstein B.Myostatin-2 gene structure and polymorphism of the promoter and first intron in the marine fish Sparus aurata:evidence for DNA duplications and/or translocations[J].BMC Genetics,2011,12:22.

[12]Pilar E Ulloa,Patricia Iturra,Roberto Neira.Zebrafish as a model organism for nutrition and growth:towards comparative studies ofnutritional genomics applied to aquacultured fishes[J].Rev Fish Biol Fisheries,2011,60（11）:9203-9220.

[13]Rodgers B D.Garikipati D K.Clinical,Agricultural,and Evolutionary Biology of Myostatin:A Comparative Review[J].Endocr Review,2008,29（5）:513-534.

[14]Oldham IM,Martyr JAK,Sharma M,et al.Normal and double muscled cattle fetuses differ in molecular expression of myostatin and myogenic regulatory factors（MRFs）but not insulin-like growth factors（IGF）[J].Endocrinology,1999,32:89-100.

[15]Amali A A,Lin C Y,Chen Y H.Up-regulation of muscle sepcific transcription factors during embryonic somitogenesis of zebrafish （Danio rerio）by knock-down of myostatin-1[J].Dev Dyn,2004,229:847-856.

[16]卢祥云，张营，王星果，等.松江鲈肌肉生长抑制素基因克隆和序列特征分析[J].动物学研究，2010，31（4）：387-394.

[17]郁建峰，张营，顾志良，等.鱤肌肉生长抑制素（MSTN）基因克隆及组织特异性表达分析[J].水产学报，2010，34（10）.

[18]徐建勇，陈松林.牙鲆肌肉生长抑制素（MSTN）基因克隆[J].水产学报，2008，32（4）：497-506.

[19]罗钧秋，陈代文.肌肉生长抑制素（MSTN）对肌肉调控的分子作用机制[J].黑龙江畜牧兽医，2007（7）：36-38.

[20]Rios R,Cameiro I.Myostatin is an inhibitor of myogenic differentiation[J].Am J Phsiol Cell Physiol,2002,282（5）:993-999.

[21]Ji S,Losinski R L,Cornelius S G.Myostatin expression in porine tissues：tissue pecificity and developmental and postnatal regulation[J].Am J Physiol,1998,27（5）:1265-1273.

[22]Xu C,Wu G,Zohar Y,et al.Analysis ofm yostatin gene structure,expression and function in zebrafish[J].The Journal of Experimental Biology,2003,206:4067-4079.

[23]Alexandra C,Mcpherron AC.Superession of body fat accumulation in myostatin-deficient mice[J].J Chinlnvelest,2002,109（5）.

[24]Fengna Li,Huangsheng Yang,Yehui Duan,et al.Myostatin regulates preadipocyte differentiation and lipad metabolism of adipocyte via ERK1/2[J].Cell Biology International,2011.

[25]薛良义，李婷，杨巧一，等.眼斑拟石首鱼肌肉生长抑制素基因克隆及组织表达分析[J].海洋学报，2008，30（3）：95-101.

[26]薛良义，孙升，杨巧一，等.大黄鱼肌肉生长抑制素基因微卫星序列多态性分析[J].中国生物化学与分子生物学报，2008，24 （10）：980-985.

[27]Maccatrozzo L,Bargelloni L,Radaell I G,et al.Characterization of the myostatin gene in the gilt head seabream（Sparus aurata）: sequence,genomic structure,and expression pattern[J].Mar Biotechnol,2001,3（3）:224-230.

[28]Maccatrozzo L,Bargelloni L,Patarnello P,et al.Characterization of the myostatin gene and a linked microsatellite marker in shi drum（Umbrina cirrosa,Sciaenidae）[J].Aquaculture,2002,205（2）:49-60.

[29]Kocabas A M,Kucu Ktas H,Dunham R A,et al.Molecular characterization and differential expression of the myostatin gene in channel catfish（Ictalurus punctatus）[J].Biochem Biophysiol Acta-Gene Struc Express,2002,1575（3）:99-107.

Research Progress of Fish Myostatin Gene

SHAO Fang,LU Xiang-yun,GU Zhi-liang
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Myostatin(MSTN),a member of transforming growth factor superfamily,is a negative regulator of skel⁃etal muscle growth.Fish MSTN gene family is complex,with various homologous genes.The structure,type,tem⁃poral and spatial expression characteristics of fish MSTN gene,mechanism and biological function of myostatin, polymorphisms of fish MSTN gene and its potential application in fish production will be reviewed in the paper.

myostatin;homologous genes;polymorphism

Q341；S917.4

A

1008-2794（2011）08-0076-05

2011-06-30

江苏省高校自然科学研究计划（09KJD240001）；苏州市2010年度科技基础设施建设项目（SZSD201001）；常熟理工学院2010大学生创新实践计划项目.

邵芳（1989—），女，江苏建湖人，常熟理工学院生物与食品工程学院生物科学专业2007级本科生.

顾志良（1968—），男，江苏常熟人，常熟理工学院生物与食品工程学院教授，博士，研究方向：动物分子遗传学，E-mail：zhilianggu88@hotmail.com.