p16在大鼠肾脏随增龄表达的变化

常 明 刘书馨 刘 焱 王志宏 付 瑶 (大连市中心医院肾内科，辽宁 大连 116033)

近年来的研究表明，p16基因(细胞周期蛋白激酶抑制物基因)不仅是一种抑癌基因，也是人类细胞衰老的主导基因。它在衰老细胞中的表达比年轻细胞高10～20倍，是细胞衰老的标志物之一。抑制p16基因表达，不仅细胞衰老速度减慢，寿命延长，而且端粒长度缩短也减慢;反之，增加p16基因表达，不仅细胞衰老速度加快，寿命缩短，端粒长度缩短也加快，提示调控p16的表达直接影响某些细胞的寿命〔1〕。肾脏功能随年龄增长逐渐下降。肾脏衰老在病理上表现为肾小球硬化、肾间质纤维化和肾动脉硬化，但缺乏特征性改变和特异性标志物，限制了肾脏衰老机制的研究。鉴于p16在细胞衰老中的重要作用，我们推测p16可能是肾脏衰老的标志之一。因此，本研究以p16为切入点，从基因和蛋白质水平观察p16在大鼠肾脏随增龄表达的变化，为进一步探讨肾脏衰老的机制寻求理想的衰老标志物。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠p16引物由北京赛百盛公司合成、小鼠p16单克隆抗体(美国Santa Cruz)、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ⅠgG(美国Santa Cruz)、PCR试剂(TaKaRa生物工程大连有限公司)、ECL显色试剂(美国 Santa Cruz)、PTC-200 DNA合成仪(美国MJ Research)、SYBR GREENⅠ染料(美国Molecular Probes)、ⅠCYCLER荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)、MⅠNⅠ-PROTEⅠN2 电泳仪(美国 Bio-Rad 公司)、ALPHAⅠMAGER2200凝胶图像分析系统(美国Alpha公司)。

1.2 实验动物及标本留取 取1日龄、3月龄和24月龄雄性Wister大鼠(由大连医科大学动物中心提供)各6只，以2%戊巴比妥(0.1 ml/kg)腹腔注射麻醉，取腹正中切口，分离双侧肾脏，去包膜留取肾组织，肾组织分为2份，1份以10%中性甲醛固定，用于制备石蜡切片，1份置于液氮冻存以提取 RNA和蛋白。

1.3 实时定量PCR检测不同月龄大鼠肾脏p16的mRNA表达 Trizol一步法提取总RNA。紫外分光光度计测浓度后取2μg RNA，使用Promega公司的反转录试剂合成cDNA模板。大鼠p16引物序列为:上游5'-GGTAATAGTGTTTTTAGAGGTG-3'，下游 5'-CTACCCTAACTAATCTATCTAC-3'，片段长度111 bp。反应条件为:94 ℃变性 5 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s、86℃ 15 s(检测荧光)，共40个循环，最后72℃延伸7 min。GADPH作为 RNA内参，引物序列为:上游 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下 游 5'-GGCATGGAC TGTGGTCATGAG-3'，片段长度116 bp。SYBR GREENⅠ作为检测染料。mRNA表达量用p16拷贝数/GAPDH拷贝数比值表示。

1.4 Western印迹分析检测不同月龄大鼠肾脏p16蛋白的表达 根据试剂盒说明提取肾组织总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取80μg蛋白上样，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转移至聚氟乙烯膜上，封闭液封闭，加入1∶200稀释的小鼠p16单克隆抗体，4℃过夜。次日0.05%TBST洗膜3次，加入1∶2 000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 ⅠgG，室温摇床1 h，0.05%TBST洗膜3次，ECL显影。以β-actin的蛋白表达作为内参照，用ALPHAⅠMAGER 2200凝胶图像分析系统进行半定量分析。

1.5 肾组织p16的免疫组化染色 采用链霉亲和素-生物素复合物技术(SP)法:肾组织经固定、脱水、石蜡包埋;常规脱蜡至水，PBS浸泡后3%过氧化氢孵育10 min，PBS洗3次，0.05%胰酶室温修复15 min，5%正常山羊血清封闭10 min后加入1∶50稀释的小鼠p16单克隆抗体，室温过夜，PBS洗3次后加入生物素标记的兔抗小鼠二抗，室温孵育40 min，PBS洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温孵育40 min，PBS洗3次，DAB显色5 min，充分冲洗后苏木素复染。400倍视野下观察p16在肾组织表达。

2 结果

2.1 不同月龄大鼠肾脏p16的mRNA表达结果 实时定量PCR的结果显示在1日龄大鼠肾脏p16的mRNA表达水平很低，在3月龄大鼠肾脏能够检测出p16的mRNA表达，在24月龄大鼠肾脏，p16的 mRNA表达显著上调(0.31±0.02 vs 1.20±0.17 vs 5.89±0.83，P＜0.05)。

2.2 不同月龄大鼠肾脏p16的蛋白表达结果 (1)Western印迹分析检测发现:在1日龄大鼠p16的蛋白表达水平低，在3月龄大鼠肾脏能够检测出p16的蛋白表达，在24月龄大鼠肾脏p16的蛋白表达显著上调。见图1。(2)免疫组化结果显示:在1日龄大鼠肾小球和肾小管几乎检测不出p16的蛋白表达;在3月龄大鼠肾小球内细胞核和肾小管上皮细胞核内可见阳性p16表达;在24月龄大鼠肾脏，肾小球内和肾小管上皮细胞核内p16表达显著上调。见图2。

图1 不同月龄大鼠肾脏p16的Western印迹结果

图2 不同月龄大鼠肾脏p16免疫组化染色结果(×400)

3 讨论

衰老是生命活动的普遍现象，其机制至今仍不清楚。肾脏衰老在功能上表现为肾小球滤过率下降，肾脏浓缩稀释功能受损，对损伤的修复能力减弱，有研究表明，衰老的肾小管上皮细胞在遭受缺血/再灌注损伤后，更易发生坏死和/或凋亡〔2〕。但肾脏衰老缺乏特异性的标志物，大大限制了对肾脏衰老机制的研究。已有大量的体外研究的结果显示p16在细胞衰老中的重要作用。细胞衰老的关键特征是细胞周期停滞。衰老细胞主要含有G1期的DNA含量，因此目前认为衰老细胞停滞于G1期，不能顺利进入S期，细胞周期G1/S转换是衰老的关键调控点。近年来的研究发现细胞衰老时，p16基因的mRNA转录及蛋白表达水平增高，抑制有丝分裂原刺激发生反应而产生RB蛋白的磷酸化，从而维持了衰老细胞不可逆的生长停滞状态〔3～5〕。尽管细胞衰老发生不可逆增殖停滞状态过程中可能发生多种变化，但p16及RB基因的表达及功能的改变可能是细胞周期停滞于G1期的根本原因。p16表达的变化也成为许多细胞如胰岛细胞〔6〕、血管内皮细胞〔7〕衰老的标志。

鉴于p16在细胞衰老中的重要作用，我们推测p16可能成为肾脏衰老的良好的分子标志物。也就是说，在肾脏衰老的进程中，p16的mRNA转录及蛋白表达水平可能发生显著变化。我们的研究结果与推测吻合。提示p16是大鼠肾脏衰老的良好的分子标志。

p16在肾脏随增龄表达上调的机制目前还不完全清楚。Krishnamurthy等的研究显示正向调控p16表达的转录因子Ets1随增龄表达上调，与p16表达平行，可能是p16随增龄表达上调的机制之一〔8〕。与此类似，Ressler等〔9〕的研究发现在衰老的皮肤，p16表达的抑制因子Bmi-1水平显著下调，可能是p16随增龄表达上调另一原因。p16随增龄表达上调另一重要机制是氧化损伤，新近的研究发现在造血干细胞，活性氧通过p38-MAPK途径激活p16表达，从而限制造血干细胞寿命，使造血干细胞丧失自我更新的能力〔10〕。p16在肾脏随增龄表达上调的机制可能与上述机制有关，但需要进一步的研究阐明。

1 Tsygankov D，Liu Y，Sanoff HK，et al.A quantitative model for age-dependent expression of the p16ⅠNK4a tumor suppressor〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2009;106(39):16562-7.

2 丁 瑞，乔 晞，陈香美，等.抗氧化剂和内质网钙释放阻滞剂对老年大鼠肾脏缺血/再灌注损伤中凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2006;26(6):779-82.

3 Elledge SJ，Harper JW.Cdk inhibitors:on the threshold of checkpoints and development〔J〕.Curr Opin Cell Biol，1994;6(6):847-52.

4 Sherr CJ，Roberts JM.Ⅰnhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinases〔J〕.Genes Dev，1995;9(10):1149-63.

5 Stein GH，Drullinger LF，Soulard A，et al.Differential roles for cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p16 in the mechanisms of senescence and differentiation in human fibroblasts〔J〕.Mol Cell Biol，1999;19(3):2109-17.

6 林晖榕，陈慎仁，傅玉才，等.不同月龄大鼠胰岛细胞衰老及胰岛素表达的研究〔J〕.中国病理生理杂志，2009;25(1):180-2.

7 单海燕，白小涓，张伟光，等.AngⅡ诱导血管内皮细胞衰老相关基因表达的研究〔J〕.中国老年学杂志，2008;24(6):1041-6.

8 Krishnamurthy J，Torrice C，Ramsey MR，et al.Ⅰnk4a/Arf expression is a biomarker of aging〔J〕.J Clin Ⅰnvest，2004;114(9):1299-307.

9 Ressler S，Bartkova J，Niederegge R，et al.p16ⅠNK4A is a robust in vivo biomarker of cellular aging in human skin〔J〕.Aging Cell，2006;5(5):379-89.

10 Ⅰto K，Hirao A，Arai F，et al.Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells〔J〕.Nat Med，2006;12(4):446-51.