巴戟天多糖对肝星状细胞片细胞中 MCP-1、IL-8蛋白表达的影响

刘 琛 赫长胜 (山东大学药学院,山东 济南 25002)

南药巴戟天(Morinda officinalis How)为我国传统名贵中药,具有抗抑郁、抗衰老、抗肿瘤以及增强免疫力等多种生物学活性〔1〕。现代研究资料表明巴戟天富含丰富的营养成分〔2〕,例如 VC、糖分及胶质以及人体所需要的有机物质。药理研究表明,巴戟天提取物巴戟天多糖有较显著的免疫增强作用〔3〕。本研究的目的在于观察巴戟天多糖对肝星状细胞片细胞中单核细胞超化蛋白(MCP)-1、白介素(IL)-8蛋白表达的影响,阐述巴戟天多糖对细胞的免疫作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株来源 肝星状细胞片细胞由北京肝病医院中心提供。主要由SV 40转染 prague dauley大鼠星状细胞组成,其表型为活化的肝星状细胞(HSC),表达较高水平的 I型胶原、TIMP-1等。进行细胞学常规复苏、传代之后,放于 5.0%CO2饱和条件下细胞培养箱内培养,备用。

1.1.2 试剂及耗材 培养基 DMEM、胰酶(美国Gibco公司)。标准的胎牛血清(北京鼎国公司),其余试剂均为国产的分析纯。 96孔细胞培养板(北京生物公司),SP染色剂、MCP-1、IL-8单克隆抗体(中山金桥公司)。

1.1.3 实验仪器 CO2培养箱,多普勒显微镜等。

1.1.4 巴戟天多糖的提取〔4〕取巴戟天粗品,粉碎,将药材烘干后,准确称取 500g,加入与体重多 10倍量的水,浸泡 30 min后,沸水浴 60 min,取溶液过滤,滤液中加入 3倍体积的乙醇,静置过夜,将乙醇滤出后收集沉淀,干燥后为巴戟天粗多糖。将粗多糖溶解于适量的蒸馏水中,采用Sevag方法将蛋白去除(重复操作 3次),加入乙醇使得浓度为 80.0%,静置过夜后,将沉淀收集。无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤,干燥。将沉淀物溶于蒸馏水,加入乙醇至溶液浓度为 70.0%,静置过夜,滤过,用 70.0%乙醇反复淋洗,沉淀干燥,即得到巴戟天多糖纯品。

1.2 方法

1.2.1 药物血清的制备 青岛大学实验动物中心药理所提供纯种的雄性 Begile犬,将巴戟天多糖纯品溶解后灌胃给药,剂量为 2.0 ml/kg(相当于成人用量的 10倍)。给药 2.5 h后,真空抗凝管抽取血液,离心,3 000r/min,离心3.0min,取上清液,加入巴戟天多糖,同时制备为血清,灭活后放于-20℃冰箱中冷冻备用。

1.2.2 培养基制备 基本培养基的配制:DMEM培养基采用三蒸水溶解,加入 3.0 g/L的 NaHCO3,2.5 g/L的 Hepes(经0.22μm微孔滤膜过滤除菌),5℃保存。完全培养基的配制:90.0%的基本培养基,10.0%的标准胎牛血清,链霉素10万 U/L。含药培养基的配制:将采集的药物血清与含有5.0%标准胎牛的基本培养基配制成 2.5%浓度的药物血清。

1.2.3 肝星状细胞片细胞的培养 细胞以完全培养基培养于37.5℃、5.0%CO2的培养箱中。当细胞生长密度为1.0×105～ 1.0×106后,按照 1∶3进行传代。

1.2.4 给药方式 取对数生长期的肝星状细胞片细胞,用0.1%胰酶和 EDTA的混合液进行消化,用完全培养基将肝星状细胞片细胞悬液调至 2.0×104/ml,接种于 96孔板中,每孔200μl。培养 24 h后加入乙醛达到终末浓度,造离体模型并更换含药的培养基,持续培养 72 h,同时每板有 3个孔常规培养的肝星状细胞片细胞作为空白对照组。72 h后,采用 5.0%多聚甲醛固定,干燥后备用。

1.3 细胞免疫组化 经冷 PBS漂洗后,120 g/L甲醇固定,再经 PBST漂洗,1.0%Triton-X 100修复,暴露抗原,冷 PBST冲洗,3.0%甲醇-过氧化氢封闭内源性过氧化物酶,蒸馏水漂洗,100ml/L山羊血清封闭非特异性结合位点,弃去血清后,分别滴加 MCP-1、IL-8单克隆抗体,5.0℃静置过夜,同时采用正常血清代替 I抗作为阴性对照。3,3'-二氨基联苯胺(DAB)显色15～20 min,乙醇逐级脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。最后置于显微镜下观察,照像并分析图像,每片截取 5个视野分析阳性信号的面密度,取平均值分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计学软件,组间比较采用独立样本的 t检验,多组数据间比较采用单因素方差分析或 χ2检验。

2 结 果

模型组肝星状细胞片细胞中MCP-1、IL-8蛋白表达较正常组减少(P＜0.05),经药物血清培养后的肝星状细胞片细胞中MCP-1及 IL-8的表达均较模型组增强(P＜0.05)。见表 1。

表1 巴戟天多糖对 MCP-1、IL-8蛋白表达的影响(±s)

表1 巴戟天多糖对 MCP-1、IL-8蛋白表达的影响(±s)

与正常组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 MCP-1 IL-8正常组 面积度(×10-3) 3.64±1.12 1.25±0.56吸光度(A) 0.154 6±0.001 2 0.112 5±0.000 5模型组 面积度(×10-3) 22.64±6.981) 13.25±7.341)吸光度(A) 0.107 8±0.002 31) 0.098 7±0.000 91)药物血清组 面积度(×10-3) 13.12±1.471)2) 6.53±1.141)2)吸光度(A) 0.257 4±0.003 11)2)0.210 4±0.002 11)2)

3 讨 论

近年来,随着人们对于多糖生物学功能的深入认识,各种天然产物中提取的生物活性多糖的研究又一次成为人们关注的重中之重,目前已经有 300多种多糖类化合物从天然产物中被分离提取出来,其中在植物中,尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要〔5〕。巴戟天即为其中最重要的一种中药材。现代研究也表明巴戟天中的营养成分较丰富,糖类物质的总量已经达到了 49.79% ～58.25%〔6〕。

HSC活化是肝纤维化发生发展的中心事件,同时淋巴细胞作为肝纤维化局部微环境中的一个主要的浸润细胞,对纤维化进程具有重要的免疫调控作用。具体表现在,活化的 HSC可以促进淋巴细胞的浸润及其在组织局部的存活;另外,淋巴细胞可以通过细胞间直接接触或旁分泌两种方式影响HSC的促纤维化功能。HSC主要通过旁分泌,即HSC可以分泌MCP-1、IL-8、巨噬细胞炎性蛋白-1α等多种趋化因子〔7〕,其中 MCP-1几乎全部是由 HSC合成,具有较强的趋化单核细胞的能力,是慢性炎症时重要的趋化信号〔8〕。

因此,本实验选取与淋巴细胞免疫功能密切相关的 MCP-1、IL-8蛋白〔9〕进行研究,探讨巴戟天多糖对星状细胞促进免疫的作用机制。巴戟天多糖刺激 HSC增殖与药物的浓度有一定的关系,在体内巴戟天多糖可以通过刺激 HSC的不断增殖而促进对淋巴细胞的作用,增进免疫系统的功能〔10〕。本实验研究发现,乙醛刺激可以使HSC激活增殖,经巴戟天多糖的药物血清培养后,MCP-1、IL-8基因蛋白表达明显增强。

综上所述,巴戟天多糖在一定程度上可以促使 HSC增殖,其给药血清中肝星状细胞片细胞中的 MCP-1、IL-8表达较模型组细胞显著增多,巴戟天多糖可能通过影响 MCP-1、IL-2等基因的表达,对免疫功能起到一定的调节作用。

1 姚 辉,赵 晟.名贵南药巴戟天〔J〕.植物杂志,2002;3(1):26-7.

2 周法兴.巴戟天化学成分的研究〔J〕.中药通报,1986;11(9):43.

3 黄彩玲,林 勇,肖柳英,等.巴戟天对 S-180荷瘤小鼠的免疫增强作用〔J〕.中药材,2009;32(11):1738-41.

4 郭素华,王和鸣,黄 涛,等.南靖巴戟天多糖的含量测定〔J〕.福建中医学院学报,2006;16(1):32-3.

5 张惟杰.糖复合物生化研究技术〔M〕.第 2版 .杭州:浙江大学出版社,2003:120-6.

6 林 励,徐鸿华,王素英,等 .不同年龄巴戟天微量元素、氨基酸及糖含量测定〔J〕.广州中医学院学报,1992;9(3):160-3.

7 Holt AP,Salmon M,Buckley CD,et al.Immune interactions in hepatic fibrosis.or“Leucocyte-stromal interactions in hepatic fibrosis” 〔J〕.Clin Liver Dis,2008;12:861-82.

8 陈彩英,詹若挺,陈蔚文.巴戟天的药理研究进展〔J〕.中药新药与临床药理,2009;20(3):291-4.

9 李 婧,蒋 炜.肝星状细胞与肝脏局部免疫调控〔J〕.国际消化病杂志,2010;30(2):68-70.

10 陈小娟,李爱华,陈再智.巴戟天多糖免疫药理研究〔J〕.实用医学杂志,2000;11(5):348-9.