HPLC测定脐带血HbF正常参考值的建立及对母血污染的评价分析

汤丽霞,欧丽群,曾劲伟,梁彩红,禤洁甜,林 蔚,陈华锦,杨 光

(广东省佛山市第一人民医院临床研究所 528000)

人类血红蛋白由两对珠蛋白链构成。在个体发育不同阶段,胚胎阶段、胎儿阶段和成人阶段,不同的α和β珠蛋白基因簇的开放与关闭控制着人体珠蛋白表型的变化。成人阶段主要表达血红蛋白A(HbA)和少量的血红蛋白A2(HbA2)。而胎儿阶段以胎儿血红蛋白(HbF)表达为主,HbA仅有少量。血红蛋白在人体发育各阶段都有正常参考值,抗碱法新生儿的HbF的正常参考值为55%～85%[1],但未见相应高效液相色谱法(HPLC)和抗碱法在妊娠中晚期检测胎儿脐带血HbF浓度的正常参考值。本文使用HPLC和抗碱法检测产前诊断中晚期妊娠胎儿脐带血HbF浓度,计算相应正常参考值范围,并应用于产前诊断抽取脐血过程中母血污染脐血的筛查。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2006年7月至2007年12月在本院进行中晚期妊娠产前诊断的孕妇抽取脐带血共116例,男性胎儿56例,女性胎儿60例。2008年1月至2010年 6月使用 HPLC检测脐带血 HbF相对含量220例,男性胎儿 119例,女性胎儿101例。

1.2 染色体核型分析 肝素钠抗凝管脐带血0.3 mL加入拜迪生产的外周血淋巴细胞培养基5 mL内,37℃培养70 h,加入秋水仙素终浓度0.04～0.08 μ g/mL继续培养 2 h,常规低渗、固定、制片、G显带程序操作,计数 20个核型,LEICA CD4000系统分析大于等于5个核型。

1.3 抗碱法HbF定量检测 方法见文献[1]。

1.4 HbF定量检测 HPLC采用美国Bio-Rad公司生产的Hb自动分析仪-VARIANTTMⅡ(β-thalassemia Short Program)及厂家提供的配套试剂。每次进行 HPLC分析时先测定厂家配套的高低两个浓度的质控品,室内质控合格才进行研究对象标本HbF的分析测定。每例标本(或质控品)取5 μ L,用1 mL的超纯水稀释,颠倒7～8次混匀后放置在专用试管架上自动分析测定,6～7 min后显示定量测定结果。

2 结 果

2.1 抗碱法测定HbF 中期妊娠脐带血标本116例中,男56例,女60例。女性标本中有2例HbF在3.0%以下,作为异常值排除,男性 HbF均值72.3%,s=13.8,女性 HbF均值72.2%,s=15.4,男女整体 HbF均数72.3%,s=14.8。秩和检验男女性别之间均值差异无统计学意义。

2.2 HPLC测定HbF 中晚期妊娠脐带血标本220例中,男119例,女101例。去掉 5例极端值,其中 4例 HbF＞100%(女1例,男3例),1例 HbF≤35%(女性)。215例中,脐带血HbF均值 94.5%,S=5.6。其中男性胎儿 HbF均值为95.2%,s=4.5;女性胎儿 HbF均值为93.7%,s=8.8。秩和检验男女性别之间均值差异无统计学意义。

2.3 染色体核型分析结果 在抗碱法检测的114例胎儿中,染色体数目异常5例,染色体结构异常 4例,染色体多态6例,共计15例。HPLC法检测的215例胎儿中,数目异常12例,结构异常3例,9号倒位8例,其他染色体多态 3例,共 26例。染色体多态和数目结构异常占整体的12.5%。

2.4 抗碱法检测HbF 单侧下限99%可信区间HbF正常参考值:百分位数法求得,整体单侧下限P0.5=48.7%,女性胎儿P0.5=48.8%,男性胎儿 P0.5=51.7%。

2.5 HPLC法检测HbF 单侧下限99%可信区间参考值:整体为P0.5=79.4%,男性胎儿 P0.5=83.5%,女性胎儿P0.5=76.2%。

3 讨 论

人类α和β珠蛋白基因簇按照其在染色体上的排列顺序由5′端向 3′端基因顺序表达和关闭,形成了个体发育的不同时期6种珠蛋白表达种类的变化。6种人类的珠蛋白分别为:HbGower1(ζ 2ε 2)、HbGower2(α 2ε 2)、Hb potland(ζ 2γ 2)、HbF(α 2γ 2)、HbA(α 2β2)、HbA2(α 2δ 2)。HbGower1 和 HbGower2在妊娠早期合成,妊娠中晚期主要为HbF,妊娠晚期出现少量HbA和HbA2。正常情况下出生后3～4个月完成成人型血红蛋白肽链转变,HbA达95%以上,少量HbA2[2]。不同血红蛋白的携氧和释氧能力不同,不同类型血红蛋白相互更替对维持正常机体的生理功能具有重要意义。成人阶段胎儿血红蛋白F的升高出现在贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、白血病或遗传性胎儿血红蛋白持续症等疾病[3-4]。本文探讨妊娠中晚期胎儿阶段HbF的下限,目的在于对产前诊断胎儿标本抽取过程母血误抽污染胎血的筛查判断。

使用抗碱法和HPLC方法检测336例产前诊断脐血HbF相对浓度,共3例女性胎儿HbF异常低下,其中1例母血污染的女胎脐带血HbF相对浓度为35%,2例女胎脐带血HbF浓度小于3%。后者属于在脐带血抽取技术开展的初期发生的误抽,其相应的HbF浓度值在计算99%可信区间单侧下限界值过程中被作为极端值去除。抗碱法和HPLC法检测HbF的数据均呈现非正态分布,进行对数转换后乃呈非正态分布。因此均采用百分位数法确定99%可信区间单侧下限正常参考值。

抗碱法是广泛使用的检测胎儿血红蛋白的方法。抗碱法检测HbF浓度健康成人为1.0%～3.8%,新生儿为55%～85%[1,5-6],使用抗碱法检测114例中晚期妊娠胎儿脐带血的HbF,计算抗碱法HbF单侧下限99%可信区间正常参考值为48.7%。抗碱法的下限界值估计结果受两侧尾部数据的影响较大,尤其是百分范围大于95%,样本含量不够大时,结果不够稳定。

HPLC方法检测HbF是继抗碱法之后更敏感、特异和准确的方法[7-10],在珠蛋白生成障碍性贫血的筛查和诊断中已广泛使用。采用HPLC方法检测215例妊娠中晚期产前诊断的脐带血HbF,用百分位数法确定99%可信区间单侧下限正常参考值HbF为79.4%。HPLC法检测HbF单侧下限99%可信区间参考值较抗碱法提高了约30%,从两种方法的统计描述中可以发现HPLC检测HbF的数据离散度较抗碱法也明显集中,均有利于母血污染脐带血的判断。

随着产前诊断技术的普及应用,临床上越来越多高危孕妇需要进行脐带血染色体核型分析[11-15]。作为产前诊断的一部分,染色体分析报告发出之前必须对脐带血的来源进行确证。胎儿脐带血与母体血液如果发生混合,可引起染色体分析结果的误判。在脐带血抽取的过程中,如果发生母血的污染或者误抽母血的情况,则脐血中HbF的相对浓度遭遇母体血的稀释,表现出HbF浓度降低。对于HbF浓度明显小于79.4%单侧下限界值的,高度怀疑为母血污染或误抽,有必要进一步采用亲子鉴定的方法予以确证。

HPLC方法提高了HbF的正常参考值下限,并且缩小了检测数据的离散度,在脐带血染色体核型分析中,是一种经济有效的筛查母血污染脐带血的方法。

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