手足口病肠道病毒EV71和CoxA16感染的检测分析

黄建国 ，吴立文 ，骆志辉 ，黄碧梅 ，刘菊花 ，刘彩珍

(1、广东省龙川县妇幼保健院检验科；2、儿科；3、广东省龙川县人民医院儿科，广东 龙川 517300)

手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，以婴幼儿发病为主。大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征。引起手足口病的病原体主要为肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)，其中EV71不仅引起HFMD，而且可引起脑膜炎、脑炎、急性迟缓性瘫痪等严重中枢神经系统并发症[1]。从1996年来，在东南亚、中国台湾、香港等地不断有HFMD暴发流行[2-3]。2008年在我国安徽和河南部分县市发生EV71感染引起的HFMD流行，并造成患儿死亡。近年，地处广东东北部山区的龙川县也出现HFMD散发病例，以每年4～6月间为发病高峰。我们收集了部分在我院和龙川县人民医院住院和门诊就诊的临床疑似手足口病的患儿标本，应用分子生物学方法对这些标本进行了肠道病毒基因检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床病例 所有病例均来自我院和龙川县人民医院2009至2010年住院和门诊病人，按照卫生部《手足口病预防控制指南(2008年版)》标准[4]，共收集临床诊断手足口病病例56例，其中男32例，女25例，年龄5月～12岁。

1.2 标本的采集 用无菌方法采集急性期病人的粪便1～2g，置于灭菌的带盖玻璃瓶中，同时用干棉签准确地擦拭患儿的鼻咽部后，立即浸泡于含2～3ml Hank＇s液的灭菌试管,以上标本均立即-70℃冻存。

1.3 实验试剂 10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、随机引物、RNAsin酶和AMV逆转录酶为Promega公司产品，病毒核酸提取试剂为美国GIBCOL公司的TRIZOL-LSReagent RNA提取试剂盒。

1.4 引物序列[5]引物由南方医科大学附属深圳宝安医院儿科张寿斌主任提供。所用的引物序列见表1。

表1 RT-PCR检测EV所用的引物及序列

1.5 EV核酸提取 采用TRIZOL-LSReagent提取总 EV RNA。 取 0．5～1g 粪便溶解于 0.5～2ml生理盐水中，充分振荡混匀，5000r/min离心5min，取150μl上清液 (或咽拭子液)，加 TRIZOL-LS Reagent 450μl， 混匀， 加 120μl氯仿，2～8℃12000g 离心15min， 取上清液加 300μl异丙醇，2～8℃12 000g离心 10min， 沉淀物用 75%乙醇 200μl洗脱，2～8℃7500g离心5min后去离子水溶解，冻存于-70℃。

1.6 EV通用引物的RT-PCR检测 逆转录合成cDNA 反 应 ： 取 5 ×AMV buffer 3.0μl，20mmol/L dNTPs 0.15μl， 随 机 六 聚 体 引 物 l.0μl，EV 模 板10μl，cDNA 反应液总体积为 15μl，反应参数：42℃，45min。采用套式PCR检测EV RNA，第一轮PCR反 应 条 件 ：cDNA 模 板 5μl，10×PCR buffer 3.0μl，20mmol/L dNTPs 0.15μl，50μmol/L EVP160/EVP580各 0.15μl，Taq 酶 1U， 反应液总体积共 30μl，在PE6000型DNA扩增仪上扩增，扩增参数：94℃预变性 180s，94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 40s，扩增 30 个循环。第二轮PCR反应条件：取第一次PCR产物3μl作模板，用 50μmol/L EVP250/EVP 500引物各0.15μl进行第二次扩增，扩增条件同第一轮。取第二轮PCR产物10μl用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色(含 EB 0.5μg/ml)，100V 电泳 30min，紫外灯下观察，约于312bp位置见清晰条带为阳性。每次均设肠道病毒标准IYW作阳性对照和PBS液阴性对照，标本处理RNA提取、PCR扩增和凝胶电泳PCR产物检测均在不同实验室进行。

1.7 RT-PCR特异检测EV71和CoxA16采用RT-nPCR检测EV71和CoxA16引物见表1，第一轮PCR扩增反应条件基本同上述通用引物检测EV，只是检测EV71第二轮PCR退火温度为58℃，检测CoxA16第二轮PCR退火温度为56℃，片段大小分别为193bp和275bp。

1.8 统计学方法 配对计数资料采用 χ2检验，P＜0.05，差别有显著性意义。

2 结果

2.1 手足口病肠道病毒RT-nPCR检测结果

用通用引物RT-nPCR检测共56例病人的标本，结果37例病人呈现总肠道病毒阳性，阳性率66.1%。再用RT-nPCR方法进行分型检测，检出EV71阳性 15份，占标本总数的26.8%；CoxA16阳性13份，占标本总数的23.2%；EV71和 CA16均阴性9例，占标本总数的 16.1%。RT-nPCR分型检测结果见图1。

图1 RT-nPCR分型检测电泳结果

2.2 不同性别婴幼儿童 EV71和CoxA16检出情况

对56份临床诊断手足口病病例中，其中男32例，女25例，男女阳性率分别为62.5%(20/32)和68%(17/25)；EV71男女阳性率分别为31.3%(10/32)和20%(5/25)；CoxA16男女阳性率分别为18.8%(6/32)和 28%(7/25)。 经统计学处理(χ2=0.6575，P＞0.05)，不同性别间EV71及CoxA16的发病率差别无统计学意义(见表 2)。

表2 手足口病病原体检测结果的性别分布(%)

2.3 不同年龄儿童EV71和CoxA16检出情况

将病例分为 6个年龄组，5岁以下儿童是 EV感染的高危人群，占85.7%(48/56)。EV71感染者中最小年龄11个月，最大8岁(见表3)。

表3 不同年龄段手足口病病原体检测结果(%)

3 讨论

人类肠道病毒(EV)属于小RNA病毒科，有近70个血清型，包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A组和B组，埃可病毒以及新型肠道病毒EV68-72型。EV感染较为常见，临床表现复杂多样，手足口病(HFMD)是其常见的临床表现之一。EV71是1972年美国学者从一脑炎病人中分离出一种新型肠道病毒，是上世纪九十年代末在东南亚部分地区爆发流行的主要病原体[3]。EV71感染以手足口病为主，部分出现严重的中枢神经系统感染，导致肺水肿和肺出血而死亡。2008年在我国的山东临沂和安徽阜阳河南等地区出现手足口病疫情，也主要由EV71型为主。我省的深圳和广州近年均有手足口病散发流行[6-7]，我县地处广东东北部山区，近年也出现HFMD散发病例，以每年4～6月间为发病高峰，为了了解在本地区出现的手足口病的血清型，我们收集了56例在我院住院和门诊就诊的手足口病病例，先采用肠道病毒5’端保守的非编码区通用引物RT-nPCR检测，并根据EV71和CoxA16病毒特异性引物,对通用引物阳性的病例进行EV71和CoxA16病毒的快速RT-nPCR分型检测，结果显示，56例临床诊断手足口病病例，37例肠道病毒通用引物 RT-nPCR检测呈阳性，阳性率为66.1%，敏感性略低于实时荧光定量 RT-PCR检出率[8]。分型检测显示，在我县流行的手足口病病原体也主要是肠道病毒EV71和CoxA16血清型，占75.7%(28/37)，与在我省的深圳和广州流行情况相似，发病以婴幼儿为主 (年龄<5岁以下儿童)，不同性别之间无明显差别。

EV的临床检测方法主要有血清学方法和分子生物学方法。血清学方法包括补体结合试验、中和试验或ELISA法，但由于EV血清型繁多，并且许多血清型抗体间有交叉反应，特异性较差，加之抗体滴度感染2周后才能达到检出水平，EV特异性血清学检测方法目前还不成熟，临床应用存在诸多限制。近年发展的检测EV感染的分子生物学方法主要有RT-nPCR和实时荧光定量PCR，具有较高的敏感性和特异性[5，9]。我们采用的是套式RT-nPCR技术，进行两次特异性引物PCR扩增，提高了检测结果的特异性，也避免一次PCR扩增出现的假阴性，增加了检测的敏感性，RT－nPCR检测当天即可完成，是一种快速、敏感和特异的方法，适合应用于对EV感染的检测和早期诊断。我们检测的56例病人中，检测的标本包括粪便和呼吸道分泌物，采用RT-nPCR均检测出EV，有报道该方法适用于呼吸道分泌物、粪便、脑脊液和组织中EV RNA的检测，是诊断EV感染的有效方法[6]。

手足口病虽然是一种自限性疾病，但EV71型感染部分侵犯脑组织，可造成患儿死亡，对EV71至今尚无疫苗预防，一旦发病没有特异性药物治疗，因此对EV71等EV采取有效的预防控制措施至关重要。包括加强对公共场所及托幼机构卫生的监测力度，实行早发现、早诊断、早报告、早隔离治疗、早处理疫点等措施。

[1]陆一涵,姜庆五.人肠道病毒 71型与手足口病[J].疾病控制杂志,2008,12(3):183-188.

[2]Ho M.An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J].New Engl JMed,1999,341(13):929-935.

[3]Cardosa MJ,Perera D,Brown BA,et al.Molecular epidemiology of human enterovirus 71 strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region:comparative analysis of the VP1 and VP4 genes[J].E-merg Infect Dis,2003,9:461-468.

[4]中华人民共和国卫生部.2008年手足口病预防控制指南[J].中华实验和临床感染病杂志,2008,2(3):210-213.

[5]张寿斌,廖 华,黄呈辉,等.应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒[J].中国医师杂志,2006,8(7):971-973.

[6]张寿斌,廖 华,黄呈辉,等.深圳237例手足口病肠道病毒血清型基因及临床特征[J].中国当代儿科杂志,2008,10(1):38-41.

[7]吴新伟,蒋力云,伍业健.广州地区 2008年手足口病病原体检测分析[J].广东医学,2009,30(5):788-790.

[8]严菊英,卢亦愚,徐昌平,等.肠道病毒 TaqMan荧光定量 RT-PCR法快速检测[J].中国公共卫生,2007,23(7):818–8201.

[9]何雅青,何丽芸,姚相杰,等.荧光定量 RT-PCR快速检测手足口病病原研究[J].中国热带医学,2008,8(10):1675-1671.