噬菌体生物扩增法直接检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究

边泽源，杨芸红，何 川，涂少华，涂荣跃

(江西省胸科医院，江西 南昌 330006)

结核病防治面临的最大困难是耐药结核菌的流行与传播；快速准确的一线抗结核药物耐药性测定是临床制定合理化疗方案的前提；异烟肼是最主要的一线抗结核药物之一，还可以作为耐多药结核病的标志之一。因此，快速准确测定异烟肼耐药性具有重要意义。

国内外已经利用分枝杆菌噬菌体D29，对临床分离的结核分枝杆菌菌株进行耐药性检测的研究，结果显示该方法有较高的特异性、敏感性[1，2]。但利用临床分离菌株进行耐药性检测仍需较长时间(3～7周)，没有真正达到快速检测的目的。我们应用噬菌体生物扩增法对临床痰标本直接进行异烟肼耐药性检测，测定结果与常规绝对浓度法结果进行比较，以评价PhaB法的临床应用价值。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 .1 待检痰标本40例，痰涂片阳性：痰检(1＋)30例，痰检(2＋)9例，痰检(3＋)1例。源于我院已确诊为肺结核病住院病人、均为临床拟诊为耐药的肺结核患者。

1.1 .2结核分枝杆菌噬菌体试剂盒 (含液体培养等)(FASTPlaque TBTM)购自上海金浩科技发展有限公司，批号G-0340；生产企业：英国BIOTEC Laboratories ltd公司生产。

1.1 .3抗结核药液的配制 异烟肼粉末(北京结核病控制中心参比实验室提供)用蒸馏水溶解成浓度为1mg/ml，-20℃保存备用，使用时用液体培养基将药物稀释成 2μg/ml。

1.2 方法

1.2 .1痰标本前处理 取合格痰标本约5ml，加适量4%的氢氧化钠，反复用玻璃棒搅打液化痰液15min；转入50ml离心管，加液体培养基至50ml，4000 r/min离心15min，去上清液，沉淀物加入液体培养基洗涤1次，去上清液，沉淀物加入1.0ml液体培养基混匀。上述前处理标本抗酸染色，根据镜检结果取 0.3ml适当稀释：1～10条/(1000×)稀释 10倍；10～50 条/(1000×)稀释 100；＞50 条/(1000×)稀释 1000[3]。

1.2 .2药物作用标本中的MTB 取上述稀释标本0.1ml+0.1ml异烟肼+0.8ml液体培养基，无菌条件下转移至反应管中，37℃孵育48h；对照组，沉淀物加1m l液体培养基，不加药物，37℃孵育48h。整个过程注意无菌操作。吸取1ml液体培养基加于反应管中，为“阴性对照”；取50μl指示细胞溶液，用液体培养基稀释106倍，随后取1ml该稀释液于反应管中，为“阳性对照”。

1.2 .3噬菌体耐药测定 噬菌体浸染、终止侵染、浇注平板、结果判断参照文献方法[4]。结果判断标准：(无药管噬菌斑-药物作用管噬菌斑)/无药管噬菌斑＞85%为敏感，反之为耐药。

1.2 .4 MTB的绝对浓度法药物敏感性检测：同时取前处理后标本按中国防痨协会制定的《结核病诊断实验室检验规程》[5]进行MTB的分离培养和异烟肼耐药性的测定。

2 结果

两种方法对40份痰标本中MTB异烟肼耐药性的检测结果比较(见表1)，PhaB法耐药23例，敏感17例；绝对浓度法检测，耐药28例，敏感12例。以绝对浓度法检测结果为判断标准，则PhaB法异烟肼耐药性检测的敏感性、特异性、准确性分别是78.57%(22/28)、91.67%(11/12)、82.50%(33/40)。Kappa检验，k＝0.63 P=0.00＜0.05，说明 PhaB 法与绝对浓度法检测结果有较好的一致性。

3 讨论

表1 PhaB法与绝对浓度法检测结果比较

由于结核分枝杆菌生长缓慢，常规药敏试验需3～7周或更长时间，不能满足临床需要；快速培养仪测定系统尽管可显著缩短时间，但需特殊仪器设备，价格昂贵；分子生物学检测技术虽有快速、灵敏的优点，但操作烦琐、技术要求高，难在临床常规应用。

PhaB法是一种快速、简便的测定MTB耐药性的新方法，是由Wilson等[1]于1997年建立，并用于利福平和异烟肼的耐药性测定。因与常规的耐药性检测结果符合率高，普遍认为这是一种极具发展前景的新方法，使其在结核病的研究中备受关注[6-8]。基本原理是分枝杆菌噬菌体D29既能感染缓慢生长的MTB，又能感染快速生长的耻垢分枝杆菌，因此当药物与MTB作用一定时间后，耐药菌能继续生长，并被随后加入的噬菌体所感染，而敏感株因被药物杀死，不能被噬菌体感染，未进入菌体内的噬菌体则被随后加入的杀毒剂杀死，进入菌体内的噬菌体不受影响，而在菌体内大量繁殖，并将细菌裂解，释放出的噬菌体可立即感染随后加入的指示细胞，并使其裂解，由于指示细胞繁殖迅速，所以24h观察到在培养皿上出现明显噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无及数量的多少即可判断待检菌株的耐药性。

由于MTB生长缓慢，目前多数研究是用临床已分离菌株进行耐药性检测，达不到快速的目的。鉴于国内尚无直接对痰标本中的MTB进行耐药性检测研究的报道，我们参照文献[4]并略作改进，设计建立了直接对痰标本快速测定异烟肼耐药性的噬菌体生物扩增法。本研究结果表明，PhaB法具有较高的敏感性和特异性，与Shriprakash Kalantri等研究结果相符[9]。

由此可见，噬菌体生物扩增法直接检测痰标本中异烟肼耐药性，对及时筛查耐药肺结核患者有重要的参考价值,该法简单、快速、不需要特殊仪器设备，4d即可获得耐药性测定结果，基本能够满足临床诊治需求；而且又有较高的敏感性和特异性，非常适合基层推广使用。此外，PhaB法将活耐药结核菌株裂解，对于有效预防、控制耐多药结核分支杆菌的传播具有重要意义。

[1]Wilson SM,Al-Suwaidi Z,McNerney R,et al.Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibilty testing of Mycobacterium tuberculosis[J].NatMed,1997,34:465-468.

[2]王 洁,崔振玲,胡忠义,等.噬菌体法同时检测四种一线抗结核药物耐药性[J].中华传染病杂志,2006,24(2):102-105.

[3]刘锡光.现代诊断微生物学[M].北京:人民卫生出版社,2002:726.

[4]彭 丽,陈保文,沈小兵,等.噬菌体生物扩增法与改良罗氏比例法在结核杆菌药敏检测中的比较[J].中国防痨杂志,2005,27(1):18-22.

[5]中国防痨协会基础专业委员会编著.结核病诊断实验室检验规程[M].中国教育文化出版社,2006.

[6]Carriere C,Riska P,Zimhony O,et al.Conditional replicating luciferase reporter phages:improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility ofmycobactetrium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,1997,35(12):3232-3239．

[7]胡忠义,倪莲娣,张莹蓉,等.噬菌体生物扩增法在分枝杆菌鉴定和药敏试验中的应用[J].中国防痨杂志,2003,25(增):63-64.

[8]韩喜琴,高微微,李传友,等.噬菌体扩增法快速筛选结核分枝杆菌对抗结核药物敏感性的研究[J].中国防痨杂志,2003,25(增):54.

[9]Kalantri S,PaiM,Pascopella L,et al.Bacteriophage-based tests for the detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens:a systematic review and metaanalysis[J]. BMC Infectious Diseases,2005,5:59.