渗透胁迫下不同地理种源白刺的生理响应

高暝,李毅,种培芳,苏世平

(甘肃农业大学林学院,甘肃 兰州730070)

白刺(Nitraria tangutorum,又称唐古特白刺)为蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺属强旱生灌木,别名沙樱桃,俗称地枣[1],分布于我国西藏东北部、甘肃、青海、新疆、内蒙古西部、宁夏西部、陕西北部的湖盆地区和风沙沿线[2]。具有抗旱、抗寒、抗风沙、耐盐碱、抗热、耐贫瘠等生态适应特性,在稳定沙漠、保护绿洲中起着重要作用;其浆果状核果可食用,具很高的经济价值[3]。

植被建设和维护是西北生态恢复与重建中最为重要的环节,而水资源短缺是我国西北地区典型的气候特点之一,干旱不仅影响植物各阶段的生长发育,而且也影响植物各种生理代谢过程。植物为了抵抗逆境会发生一系列生理生化反应,这些适应性反应有利于植物的自我保护、经济利用水分并在缺水的环境中生存。植物的抗旱性主要是渗透调节物质的增加、膜脂成分的变化、自由基的清除作用以及蛋白的诱导形成激素调节作用等综合因素作用的结果。研究植物对干旱环境的响应是干旱区树种选择的基础,也是决定植被恢复成败的关键因素之一[4]。

聚乙二醇(PEG-6000)是一种大分子聚合物,能够夺取水分对植物造成渗透胁迫[5]。Kaufmann[6]对PEG反复研究后得出的结论是,PEG-6000诱导水分逆境所得的效果与将土壤逐步干旱是一样的。自1979年首次以PEG做为诱导剂和筛选剂筛选出抗旱的烟草(Nicotiana tabacum)细胞系[7]以后,相继出现很多研究成果:马彪[8]以PEG-6000作为耐旱性选择剂初步获得耐旱性甘薯(Dioscorea esculenta)植株,彭剑涛和向结[9]利用烟草叶片产生的愈伤组织在含PEG的培养基上筛选,获得了对水分胁迫具有抗性的愈伤组织。迄今有一些学者对白刺属植物进行过一些研究,主要侧重于植物化学成分分析[10,11]、栽培技术[12]、防风固沙的生态功能[13,14]、耐盐性研究[15]、对水分变化的影响[16]等方面,而未见PEG胁迫处理的研究,尤其是对不同地理种源白刺的胁迫研究更少。本研究通过PEG-6000渗透胁迫处理武威、张掖及酒泉3个地理种源的白刺,探讨其在渗透胁迫下各抗旱指标的变化规律及不同地理种源白刺对干旱胁迫的响应机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设计

1.1.1 材料选择 于2008年9月在甘肃武威、张掖、酒泉3个种源地有代表性的地段确定优良种质资源收集区,在每个种源区的每个样地通过表型优株选择来采集种子。不同地理种源的地理位置和生态因子见表1。

1.1.2 材料处理 种源育苗试验点设置在武威市林基中心温室。林基中心位于103.16°E,38.41°N,年均温7.8℃,7月均温23℃,1月均温-10℃,年均降水量190 mm;温室内温度28℃,湿度75%。于2009年4月上旬播种,播种前种子用0.5%的高锰酸钾溶液消毒20 min左右后清水冲洗,再用30～40℃温水浸种12 h,然后播种于培养穴中,基质成分为沙土10%～20%,沙壤土60%～80%,腐熟的羊板粪10%～20%。待苗龄30 d时,选取生长一致的幼苗,分为4组,每组3个重复,用浓度梯度为0(CK),5%,10%,15%,20%PEG-6000进行胁迫处理。各浓度分别于处理12,24,48和72 h后摘取叶片进行相对含水量(relative water content,RWC)、丙二醛(malondiadehyde,MDA)、脯氨酸(proline,Pro)、可溶性糖(soluble sugar,SS)、可溶性蛋白含量(soluble protein,SP)及几种抗氧化酶活性的测定。

表1 白刺种源地理位置及生态因子Table 1 Geographical position and ecological factors of N.tangutorum provenances

1.1.3 生理指标的测定方法 相对含水量采用烘干法测定[17];丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定[18];脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定[18];可溶性糖含量采用蒽酮乙酸乙酯比色法测定[18];可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[18];超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性采用核黄素-NBT法测定[18];过氧化氢酶(catalase,CAT)活性采用紫外吸收法测定[19]。

1.2 统计分析

各试验重复3～5次,显著性分析通过软件SPSS 17.0的多因素方差分析完成,取 P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著,多重比较分析方法为Duncan法;用 Excel 2003进行绘图。

2 结果与分析

2.1 PEG胁迫对3个地理种源白刺叶片相对含水量的影响

植物组织相对含水量反映了植物体内水分亏缺程度。武威种源叶片相对含水量高于张掖、酒泉种源(表2),随胁迫浓度增大和胁迫时间延长,3个种源白刺叶片相对含水量均呈下降的趋势,在胁迫72 h下降至最低值,且与对照差异显著(P<0.05)。但不同种源变化有差异,其中武威种源降幅最大,较对照下降71.21%,其次为张掖种源,较对照下降 68.31%,酒泉种源较对照下降57.64%。

表2 PEG胁迫下3个地理种源白刺叶片相对含水量的变化Table 2 Change of relative water content of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances during PEG osmotic stress

2.2 PEG胁迫对3个地理种源白刺膜脂过氧化的影响

丙二醛是植物细胞脂质过氧化作用的主要产物之一,其含量可表示膜脂过氧化作用的程度。3个种源白刺丙二醛含量均随胁迫浓度增大和胁迫时间延长而呈上升的趋势(图1),只是在胁迫时间较短时,丙二醛含量比对照涨幅大,胁迫时间较长时涨幅减缓,但整体水平仍升高。3个种源白刺丙二醛含量峰值均出现在20%PEG浓度和72 h胁迫时,且与对照差异显著(P<0.05)。方差分析结果显示3个种源与对照的丙二醛含量差异显著(P<0.05),其中武威种源丙二醛积累最明显,其次为酒泉种源,张掖种源丙二醛积累最小。

2.3 PEG胁迫对3个地理种源白刺抗氧化物酶活性的影响

3个种源超氧化物歧化酶活性均呈上升趋势(图2)。张掖种源各浓度峰值均出现在胁迫72 h后,其中5%PEG浓度超氧化物歧化酶活性涨幅最大,较对照增大了316.1%。武威、酒泉2个种源在低PEG浓度(5%)胁迫时,超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势,且与对照无显著差异(P>0.05);在10%,15%,20%PEG浓度胁迫时,超氧化物歧化酶活性呈不断升高的趋势,均在胁迫72 h达到峰值。方差分析结果显示,3个种源处理与对照间的超氧化物歧化酶活性均无显著差异(P>0.05)。

图1 PEG胁迫对3个地理种源白刺丙二醛含量的影响Fig.1 Effect of PEG osmotic stress on content of MDA in the leaves of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances

图2 PEG胁迫对3个地理种源白刺超氧化物歧化酶活性的影响Fig.2 Effect of PEG osmotic stress on S OD activity in the leaves of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances

不同胁迫处理后,过氧化氢酶活性差异较大(图3)。低浓度胁迫(5%)处理后,3个种源酶活性均呈先升后降的趋势,武威、张掖种源峰值出现在胁迫24 h后,较对照分别增加了464.6%和276.9%,酒泉种源峰值出现在胁迫48 h后,较对照分别增加了149.8%,均与对照差异显著(P<0.05),但胁迫72 h后,3个种源酶活性均降到了对照水平以下。中浓度胁迫(10%和15%)下,3个种源酶活性均降到对照水平以下。20%胁迫处理后,3个种源酶活性均呈先升后降的趋势,峰值均出现在48 h,但到72 h时,酶活性均降到了对照水平以下。方差分析结果显示,3个种源与对照的过氧化氢酶活性差异显著(P<0.05),其中酒泉种源过氧化氢酶活性积累最大,其次为张掖种源,武威种源积累最小。

2.4 PEG胁迫对3个地理种源白刺渗透调节物质的影响

3个种源脯氨酸含量均随胁迫浓度增大和胁迫时间延长而呈上升的趋势(图4),其峰值均出现在胁迫72 h时,且与对照差异显著(P<0.05)。方差分析结果显示,3个种源与对照的脯氨酸含量差异显著(P<0.05),其中酒泉种源脯氨酸含量积累最大,其次为张掖种源,武威种源积累最小。

图3 PEG胁迫对3个地理种源白刺过氧化氢酶活性的影响Fig.3 Effect of PEG osmotic stress on CA T activity in the leaves of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances

图4 PEG胁迫对3个地理种源白刺脯氨酸含量的影响Fig.4 Effect of PEG osmotic stress on content of Pro in the leaves of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances

张掖种源的可溶性糖含量随胁迫浓度增大和胁迫时间延长呈上升的趋势(图5),各浓度可溶性糖含量峰值均出现在72 h,且与对照差异显著(P<0.05)。而武威、酒泉2个种源可溶性糖含量则呈先升后降的趋势,胁迫12 h时,各浓度可溶性糖含量达到峰值,且与对照差异显著(P<0.05);到24 h后,武威、酒泉2个种源的可溶性糖含量开始下降,但依然显著高于对照。方差分析结果显示,3个种源与对照的可溶性糖含量差异显著(P<0.05),其中酒泉种源可溶性糖含量积累最大,其次为张掖种源,武威种源积累最小。

2.5 PEG胁迫对3个地理种源白刺可溶性蛋白含量的影响

3个种源可溶性蛋白含量均随胁迫浓度增大和胁迫时间的延长呈升高的趋势(图6),3个种源的可溶性蛋白含量峰值均出现在20%浓度和72 h胁迫时,且与对照差异显著(P<0.05)。方差分析结果显示,3个种源与对照的可溶性蛋白含量差异显著(P<0.05),其中张掖种源可溶性蛋白含量积累最大,其次为酒泉种源,武威种源积累最小。

图5 PEG胁迫对3个地理种源白刺可溶性糖含量的影响Fig.5 Effect of PEG osmotic stress on content of SS in the leaves of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances

图6 PEG胁迫对3个地理种源白刺可溶性蛋白含量的影响Fig.6 Effect of PEG osmotic stress on content of SP in the leaves of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances

2.6 各生理指标相关性分析

3个种源的丙二醛含量与超氧化物歧化酶活性、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量均呈极显著相关(P<0.01)(表3),相对含水量与超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量均呈极显著负相关,张掖种源的脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性之间呈极显著相关(P<0.01),武威种源的脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量之间呈显著或极显著相关,酒泉种源的脯氨酸与可溶性蛋白含量之间呈极显著相关(P<0.01),其他各指标相关不显著。

2.7 主成分分析

由于前3个特征值累计贡献率达到85.192%,所以可以对白刺的这3个主成分进行分析,各主成分及其携带的信息是:第1主成分:相对含水量、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛,第2主成分:SOD,第 3主成分:CAT(表4)。

表3 PEG渗透胁迫下3个地理种源白刺各生理指标相关性分析Table 3 Correlation analysis of physiological index of N.tangutorum of three kinds of geographic provenances under PEG osmotic stress

表4 白刺抗旱指标的主成分分析Table 4 Main components analysis of drought stress indexes of N.tangutorum

3 讨论

植物对逆境的反应涉及到植物体内一系列生理生化变化。当植物处于逆境胁迫时,体内会迅速积累活性氧自由基,积累的氧自由基首先攻击膜系统,膜脂脂肪酸中的不饱和键被过氧化,最终形成丙二醛[20]。丙二醛是检测植物膜伤害的一个重要的指标,其含量可以表示膜脂过氧化水平和膜结构的受害程度[21]。丙二醛含量的增加说明植物的保护机制不能有效修补活性氧对植物膜系统造成的破坏,水分亏缺影响膜的组成和更新[22]。而植物在长期的进化过程中也形成了一系列的抗氧化酶和抗氧化剂来对抗与清除活性氧[23],如超氧化物歧化酶与清除超氧阴离子自由基有关,而过氧化氢酶与清除过氧化氢有关。本试验中,3个种源丙二醛含量均随胁迫浓度的增大和胁迫时间的延长呈升高的趋势,只是在胁迫时间较短时,丙二醛含量较对照升高幅度大,胁迫时间较长时升高幅度减缓。说明在渗透胁迫下,3个种源白刺均受到膜脂过氧化的作用,而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性变化在胁迫进程中有所不同。3个种源白刺在不同程度的水分胁迫下均能靠超氧化物歧化酶活性来防止超氧阴离子自由基的毒害,只是酒泉种源超氧化物歧化酶活性的峰值远远大于其他2个种源,达到了613.76 U/g,武威种源为579.87 U/g,张掖种源最小,为361.78 U/g;3个种源过氧化氢酶活性变化较复杂,在低水分胁迫下,过氧化氢酶活性升高,说明白刺通过过氧化氢酶活性的升高来解除H2O2对其的毒害,其中酒泉种源的过氧化氢酶活性峰值最大,武威种源最小;但随着胁迫程度的增加,过氧化氢酶活性降低,暗示此时白刺细胞内活性氧形成与清除之间的平衡被破坏。比较2种保护酶活性变化,在对白刺干旱胁迫的初期和中期,过氧化氢酶在活性氧的清除方面可能发挥着主要的作用,干旱胁迫末期,超氧化物歧化酶的作用可能更大,因为3个种源超氧化物歧化酶活性峰值均出现在末期。而且相比之下,酒泉种源的保护酶活性更高,它在干旱耐受性方面可能比张掖与武威种源更加稳定。相关分析表明,3个种源丙二醛与超氧化物歧化酶活性呈极显著相关,可以说明胁迫后期丙二醛含量增加速度变缓与此时抗氧化酶活性增强有关。同时,相比之下白刺脂质过氧化程度武威种源>酒泉种源>张掖种源。

植物组织相对含水量是生理状态的一个重要指标,叶片能够维持较高含水量被认为是植物在水分亏缺下是否维持生长的一个很好指示[24],且叶片相对含水量与水势相比是更好的水分状况指标,它能够很好地反映出水分状况与蒸腾作用之间的平衡关系[25]。本试验中武威种源白刺叶片相对含水量高于张掖、酒泉种源,随胁迫浓度增大和胁迫时间延长,3个种源白刺叶片相对含水量均呈下降的趋势,但幅度不同:武威种源下降幅度最大,张掖种源次之,而酒泉种源降幅最小。充分说明酒泉种源相对含水量的下降速度较武威、张掖种源缓慢,更能忍耐干旱的胁迫。

不同逆境下,植物代谢反应的总趋势是一致的,即水解作用增强,合成作用减弱,从而使得植物体内淀粉、蛋白质等大分子化合物降解为可溶性糖、肽和氨基酸等物质,因此,逆境胁迫下植物体内的渗透调节物质会增加[26]。渗透调节物质包括如可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸及游离氨基酸等[27]。可溶性糖的主动积累,可以参与降低植物体内渗透势,以利于植物在干旱逆境下维持植物体正常生长所需水分,提高抗逆适应性[28]。脯氨酸是一种理想的渗透调节物质,主要调节细胞中的渗透势,同时对酶、蛋白质和生物膜起保护作用[29]。可溶性蛋白质含量与植物调节细胞渗透势有关,高含量的可溶性蛋白质可维持植物细胞较低的渗透势,抵抗水分胁迫伤害。本试验中3个种源白刺脯氨酸含量与可溶性糖含量在渗透胁迫后均高于对照,说明脯氨酸和可溶性糖是白刺的渗透调节物质,同时看出脯氨酸和可溶性糖积累能力均为酒泉种源>张掖种源>武威种源。3个种源白刺可溶性蛋白含量均随胁迫浓度增大和胁迫时间延长呈升高的趋势,支持了可溶性蛋白含量与植物调节细胞渗透势相关的观点。同时看出,白刺可溶性蛋白含量积累能力张掖种源>酒泉种源>武威种源。

从相关分析结果看出,3个种源丙二醛与超氧化物歧化酶、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖均呈极显著相关,相对含水量与超氧化物歧化酶活性、可溶性蛋白、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量均呈极显著负相关,脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶活性之间呈极显著或显著相关,说明渗透胁迫一方面对白刺细胞膜造成伤害,导致膜质过氧化产物丙二醛含量的增加,一方面又刺激超氧化物歧化酶活性的增强,加快自由基的清除,以减轻膜脂过氧化程度;同时通过脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的升高、相对含水量减少,使白刺细胞维持较低的水势,以增加叶片细胞的保水能力,抵抗PEG胁迫的伤害。主成分分析中,第1主成分为相对含水量、膜脂过氧化产物丙二醛和渗透调节物质脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白,可将第1主成分认为是表现白刺“渗透调节能力”的性质,这是白刺叶片在遭受水分胁迫后,代谢补偿能力的综合反应。第2主成分为超氧化物歧化酶,第3主成分为过氧化氢酶,均为防止膜脂过氧化的膜保护酶类,因此,可将第2,3主成分认为是表现白刺“维持膜结构功能的稳定性”的性质。

综上所述,白刺耐旱性是受保护酶活性、渗透调节物质等共同调节的。在PEG胁迫下,酒泉种源的大部分生理指标的积累能力最强,武威种源最弱;而膜质过氧化产物丙二醛积累能力为武威种源最强,酒泉种源最弱。说明耐旱性酒泉种源>张掖种源>武威种源,这可能与种源原生境有关,酒泉种源的生境年降水量小,海拔高,长期的低水分条件已驯化其较强的抗旱性;而武威生境与其他两生境相比年降水量大,故导致其抗旱性较弱,而更可靠的结论还有待于进一步试验验证。

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