质子剂量和DNA浓度对DNA损伤的影响

隋 丽 王 潇 周平坤 倪嵋楠 孔福全杨 磊 刘建成 赵 葵

1 (中国原子能科学研究院 北京 102413)

2 (军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京 100850)

空间环境的辐射源主要是银河系宇宙射线和随机发生的太阳粒子辐射(质子事件)。其中，质子含量最丰富，其次为α粒子和少量重离子[1]。模型计算表明[2−4]，飞往火星途中，每隔数天宇航员体内的每个细胞就会被一个质子击中。因此，为合理估算空间辐射危害，质子是需考虑的关键粒子之一。

质子的电离本领和穿透能力强，径迹结构复杂，穿过生物介质时，可通过辐解水产生的自由基或直接电离分子的方式使DNA发生损伤。Hada等[5]用带电离子束(p、Fe、C、Ti 和Si)照射线性T7 基因组DNA 水溶液，发现 1 GeV质子照射产生的DNA损伤谱十分类似于高能铁离子和其它重带电粒子的DNA 损伤谱，与X 和γ射线相比，质子能引起更多的诱发生物体潜在致死的DNA双链断裂。DNA具有传递遗传信息、启动细胞分裂及控制蛋白质(包括酶)生物合成等生理功能[6]，是电离辐射引致细胞杀伤或转化的主要靶分子。因此，测量DNA 损伤，评估质子所致生物效应，对于太空人员的健康危险性防护及放射治疗肿瘤最优化等具重要意义。

Leavitt等[7]用 32–2300 MeV 的质子照射了2000只恒河猴和5000只小鼠，研究了不同能量质子诱发的相对生物学效应(RBE)。研究结果表明，较低能量质子的穿透力有限，高剂量照射会引起严重的表面损伤；高能质子(>38 MeV)的生物效应与相同剂量的60Co γ射线相似，其RBE≈1。Clapp等[8]用 60 MeV质子辐照小鼠，得质子诱发肿瘤的RBE≤1。Burns等[9]用10 MeV质子照射大鼠，则发现诱发皮肤肿瘤的RBE≈3。因此，评价质子诱发的生物学效应还需更多研究，以得到更多的实验数据。

本文以超螺旋质粒DNA为实验对象，使用凝胶电泳技术，研究了剂量和DNA浓度对质子诱发的DNA链断裂产额的影响以及甘露醇的防护作用。

1 材料与方法

1.1 DNA样品

样品pUC19质粒DNA由宝生物工程(大连)有限公司制备，用CsCl-EtBr 密度梯度超离心法纯化获得，样品溶于 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和 1 mmol/L EDTA缓冲液中保存。样品为含90%以上双链共价闭环超螺旋形态，分子长度为2 686碱基对(bp)，原始浓度500 ng/μL。实验中，DNA样品分别处于未添加或添加600 mmol/L甘露醇的两种溶液体系中。在DNA浓度响应实验中，DNA原始溶液用三重蒸馏水分别稀释至 10、20、40、50、100 ng/μL的不同浓度，随浓度增加，含水量依次减少。在剂量响应实验中，DNA溶液浓度均为20 ng/μL，每个样品的含水量相同。

1.2 质子辐照

辐照在中国原子能科学研究院 HI-13 串列加速器上进行。质子束经金靶散射，再经 Q3D 磁谱仪偏转和散焦，穿过50 μm 厚的Kapton 膜后，在大气环境下对置于微量离心试管中体积为10 μL的不同DNA 样品进行均匀辐照。经过膜和空气层的能量损失，到达样品表面时质子能量～16 MeV，对应的LET值(水中)～3.2 keV/μm，射程～2.79 mm。由于DNA样品量较少，样品高度对LET值的影响可忽略不计，加入甘露醇后对射程也无明显影响。辐照剂量由位置灵敏探测器监测，剂量点有10、20、30、40、50、100、200、300、650 Gy。每种样品有两个平行样。辐照完成后，将对照(未辐照)和辐照DNA样品存于–20ºC冰箱内备用。

1.3 凝胶电泳分析

将对照和辐照DNA样品分别加入0.2倍体积6×载样缓冲液，点入 1%琼脂糖凝胶板，琼脂糖凝胶中加入 0.5%的溴化乙锭(Ethidium Bromide，EtBr)，每孔加样0.1 μg。用DYY-5型双稳定时电泳仪(北京六一仪器厂)，电压4 V/cm，在0.5×TBE(44.5 mmol/L Tris, 44.5 mmol/L硼酸和1 mmol/L EDTA)缓冲液中电泳 90 min，用 AlphaEaseFC成像系统(Alpha Inotech公司，美国)获取凝胶电泳图像，并用配套离线软件对电泳图像中各区带进行定量分析。实验误差为两组平行样实验的标准差。辐照样品链断裂产额与对照样品相比，p<0.05。未加甘露醇样品的链断裂产额与加甘露醇样品相比，p<0.01。

2 实验结果和讨论

2.1 DNA浓度对DNA损伤的影响

图1中，泳道C为对照DNA样品，泳道1–5为50 Gy质子辐照DNA样品，由左至右DNA浓度依次为100、50、40、20、10 ng/μL。由图1(a)，随着DNA浓度的降低，完整的超螺旋(Supercoiled, SC)形态的DNA逐渐减少，发生单链断裂的开环(Open Circular, OC)形态的 DNA逐渐增加；在低于 20 ng/μL浓度的DNA样品中还出现少量发生双链断裂的线性(Linear, L)形态的DNA分子。图1(b)中的各样品也表现出类似的DNA浓度响应，DNA浓度越低，单链断裂越明显，但所占比例均低于未添加甘露醇的同浓度DNA样品。

用AlphaEaseFC StandAlone分析软件，对凝胶电泳实验不同DNA样品的电泳区带进行密度扫描和积分计算，得到不同浓度下，质子辐照前后DNA样品中三种分子形态(SC、OC、L)所占百分比，由式(1)、(2)计算 DNA链每质粒分子单链断裂(SSB)和双链断裂(DSB)数[10,11]：

式中，f (L)和f (SC)分别为线性和超螺旋DNA的份额。

图1 16 MeV质子辐照50 Gy的DNA的电泳图谱，泳道1–5的DNA浓度分别为100, 50, 40, 20, 10 ng/μL (a)未添加甘露醇，(b)添加甘露醇Fig.1 Gel electrophoresis images of DNA solution of 100, 50, 40, 20 and 10 ng/μL (for Channel 1–5, respectively), without (a) or with (b) mannitol, irradiated to 50 Gy by 16 MeV proton beams. Channel C is the control.

由图2，对未加入甘露醇的DNA溶液，DNA浓度由10 ng/μL增至100 ng/μL，每个质粒的单链断裂数由0.98迅速减至0.1左右，表现出较好的指数衰减规律。表明DNA浓度较低的溶液环境更利于质子辐解自由基的扩散，使一个DNA分子受到有效攻击的自由基数更多，从而产生较严重的损伤。DNA浓度较高，则DNA分子间会有较多重叠，较致密地聚集在一起，使自由基只能攻击外围的DNA分子，阻止了自由基在溶液中的扩散，降低了对DNA分子结构的破坏作用。加有甘露醇的DNA样品中出现的DNA浓度效应，变化趋势相对平缓，浓度由10 ng/μL增至100 ng/μL时，每质粒SSB仅由0.29降至0.1。表明甘露醇具有清除自由基的能力，在DNA浓度低于20 ng/μL的溶液环境下尤为有效。当DNA浓度>40 ng/μL时，两种体系下SSB数目相差不多，特别是100 ng/μL时，SSB数目几乎相当(图2)，这表明DNA浓度效应可能主要源于DNA样品的含水量。另一方面，这也反映了DNA浓度越高，在使DNA发生断裂的反应机制中，质子直接作用于DNA分子所致断裂比例可能会越多。

图2 每质粒DNA单链断裂数目随受照DNA溶液浓度的变化曲线Fig.2 Number of SSB per plasmid as a function of DNA concentration.

图3表明，在不同DNA浓度溶液环境下，剂量对DNA损伤的影响符合靶学说关系[12]：

式中，D为辐照剂量，D37为SC%降至37%时的辐照剂量，N0为DNA的原始数，N为受剂量D后的未失活分子数。将各点数据用(3)式拟合后，得到10 ng/μL和100 ng/μL DNA样品的D37分别为50 Gy和560 Gy，两者相差十倍之多。表明在本实验研究范围，若想达到相同程度的DNA损伤，受照DNA溶液浓度越低所需辐照剂量越小。

图3 质子辐照前后残余SC型DNA的剂量响应曲线Fig.3 Dose response curves of fraction of residual SC-type DNA before and after protons irradiation.

2.2 剂量对DNA损伤的影响

图4(a)为三种形态的DNA分子随剂量的变化情况，可以看出，随着辐照剂量的增加，DNA分子形态由完整的SC逐渐向OC和L型转变。50 Gy时，OC形态成为主要成分，且出现少量的线性，即发生双链断裂的DNA分子。200 Gy时，SC型DNA分子完全消失，主要为OC和L型。电泳图谱显示此时L型DNA分子还出现拖带现象，并逐渐变成无明显带型的DNA“Smear”，这是由于照射造成不同大小DNA片段的产生，此现象越明显，说明DNA损伤越严重。剂量达650 Gy，就不再存在SC型和OC型的DNA分子，均表现为长短不同的L形态，即均已发生双链断裂。图4(a)还显示，SC型和L型DNA随剂量增加分别表现为单调递减和递增，而OC型则是先增后减，表明一部分已发生单链断裂或其它单一损伤的DNA分子再次被自由基或质子击中而发生了二次或多次损伤，进一步转化为双链断裂。

图4(b)为加有600 mmol/L甘露醇的DNA样品中三种分子形态随剂量的变化，DNA分子也表现出相似的剂量响应，即随着剂量的变化DNA断裂越来越严重，但主要以单链断裂为主，仅在 650 Gy出现极少量的双链断裂，与图4(a)相比，损伤程度远低于相同受照剂量未加甘露醇的DNA样品。我们用γ射线和7Li离子辐照质粒DNA时也观察到类似现象[13−15]。与γ射线结果相比，在相同剂量下，质子辐照后DNA样品中的L型比例明显较高，表明质子具备更强的诱发双链断裂的能力，即具有较高的RBE。

由图5(a)，对于未添加甘露醇的体系，100 Gy时每质粒SSB数目已达2.2，更高剂量下，单链断裂的DNA分子进一步发生断裂，完全转化为双链断裂。而对于添加甘露醇的体系，在650 Gy时每质粒的SSB数仅为0.8左右。

图4 质子辐照前后未添加(a)和添加了甘露醇(b)的DNA分子三种形态所占比例与剂量的关系Fig.4 Fraction of three forms of DNA solution without (a) or with mannitol (b) as function of. dose before and after protons irradiation.■ SC-type DNA, ● OC-type DNA, ▲ L-type DNA

由图5(b)，添加甘露醇的DNA样品中无明显的双链断裂，650 Gy时每质粒DSB为0.01，而未加甘露醇的DNA样品中在300 Gy时就已达到2.3左右，剂量增至650 Gy，所有的DNA分子都发生了双链断裂。这些现象表明，加入高浓度的甘露醇后，由质子辐解水而产生的˙OH主要与甘露醇分子反应，溶液中自由˙OH大多被清除，与DNA分子反应的有效˙OH较少，从而减少了DNA链断裂损伤的发生，起到了保护DNA分子的作用。而未被抑制的 DNA单链断裂，则主要由质子直接攻击DNA分子，将能量沉积在DNA链上使其发生断裂而产生。

由图 5(b)还可见，对于未添加甘露醇的 DNA溶液体系，每质粒DSB数目与剂量有极好的线性-二次方关系，说明DNA双链断裂是能量沉积的单击和双击事件的共同结果。未能被甘露醇清除的DSB主要由直接作用和局部多重损伤位点(LMDS)理论所述的刺团(spur)内˙OH引起，这与我们用质子辐照加入红景天苷的pUC19质粒DNA实验中观察的结果相符[16]，进一步表明质子照射致DNA损伤中自由基作用占主导地位，而质子的直接作用也不可忽视。

图5 质子辐照前后添加(●)和未添加(■)甘露醇的DNA样品中每质粒单链断裂(a)和双链断裂(b)与剂量的响应Fig.5 Dose responses of SSB (a) and DSB (b) per plasmid in DNA solution with (●) and without (■) mannitol before and after protons irradiation.

3 结语

质子具有极强的诱发质粒DNA损伤的能力，损伤程度与辐照剂量和DNA溶液浓度密切相关。甘露醇能清除辐射过程中产生的自由基，有效减少质子诱发的DNA链断裂的产生，具有一定的质子辐射防护能力。甘露醇的保护作用及DNA溶液浓度对链断裂产额的影响表明，在水溶液环境下，质子辐射诱发的DNA链断裂是直接作用和自由基间接作用的共同结果，而自由基的作用为主导因素。

1 杨垂绪, 梅曼彤. 太空放射生物[M]. 广州: 中山大学出版社, 1995: 7–12

YANG Chuixu, MEI Mantong. Space radiobiology[M]. Guangzhou: Zhongshan University Press, 1995: 7–12

2 Hada M, Meador J A, Cucinotta F A, et al. Chromosome aberrations induced by dual exposure of protons and iron ions[J]. Radiat Environ Biophys, 2007, 46: 125–129

3 Schimmerling W, Cucinotta F A. Dose and dose rate effectiveness of space radiation[J]. Radiat Prot Dosim, 2006, 122(1–4): 349–353

4 徐冰心, 岳茂兴. 航天辐射危害及其防护剂研究进展[J]. 中华航空航天医学, 2005, 16(1): 72–74

XU Bingxin, YUE Maoxing. Radiation hazards in manned space flight and advancement in research of Radioprotector[J]. Chin J Aerospace Med, 2005, 16(1): 72–74

5 Hada M, Sutherland B M. Spectrum of Complex DNA Damages Depends on the Incident Radiation[J]. Radiat Res, 2006, 165: 223–230

6 阎隆飞, 张玉麟. 分子生物学[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 1997: 26–39

YAN Longfei, ZHANG Yulin. Molecular biology[M]. Beijing: China Agricultural University Press, 1997: 26–39

7 Leavitt D D. Analysis of primate head irradiation with 55-MeV protons[J]. Radiat Res, 1991, 126(2): 127–131

8 Clapp N K, Darden E B, Jernigan M C. Relative effects of wholebody sublethal doses of 60 MeV protons and 300kVp X rays on disease incidences in RF mice[J]. Radiat Res, 1974, 57(1): 158–186

9 Burns F J, Albert R E, Vanderlaan M, et al. The dose response curve for tumor induction with single and splite doses of 10 MeV protons[J]. Radiat Res, 1975, 62: 598

10 Spotheim-Maurizot M, Charlier M, Sabattier R. DNA radiolysis by fast neutron[J]. Int J Radiat Biol 1990, 57(2): 301–313

11 Shao C, Saito M, Yu Z. Formation of single- and double-strand breaks of pBR322 plasmid irradiated in the presence of scavengers[J]. Radiat Environ Biophys, 1999, 38: 105–109

12 夏寿萱. 放射生物学[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 1998: 46–49

XIA Shouxuan. Radiation biology[M]. Beijing: Military Medical Science Press, 1998: 46–49

13 隋 丽, 郭继宇, 孔福全, 等. 高LET的7Li离子致DNA损伤的直接和间接作用研究[J]. 核技术, 2007, 30(4): 250–254

SUI Li, GUO Jiyu, KONG Fuquan, et al. Investigation of direct and indirect interaction of DNA damage induced by high LET7Li ions[J]. Nucl Tech, 2007, 30(4): 250–254

14 孔福全, 王 潇, 倪嵋楠, 等. γ射线诱导 DNA损伤中DNA浓度和剂量率的影响[J]. 原子核物理评论，2007, 24(2): 103–107

KONG Fuquan, WANG Xiao, NI Meinan, et al. Effect of concentration of DNA and dose rate in DNA damage induced by γ ray[J]. Nucl Phys Rev, 2007, 24(2): 103–107

15 杨明建, 孔福全, 展 永, 等. 各种自由基清除剂在γ射线辐照 DNA损伤中的作用[J]. 核技术, 2007, 30(4): 255–257

YANG Mingjian, KONG Fuquan, ZHAN Yong, et al. A study of protective action of different scavengers on DNA damage induced by γ rays[J]. Nucl Tech, 2007, 30(4): 255–257

16 孔福全, 王 潇, 隋 丽, 等. 不同浓度红景天苷对 γ射线和质子辐照质粒 DNA的影响[J]. 激光生物学报, 2010, 19(5): 559–602

KONG Fuquan, WANG Xiao, SUI Li, et al. The protective effect of salidroside on DNA damage irradiated by protons and γ rays[J]. Acta Laser Biology Sinica, 2010, 19(5): 559–602