盐芥TOR基因的克隆及对盐芥生长发育的影响*

王臻吴春霞扈玉婷张慧赵彦修

(山东师范大学山东省逆境植物重点实验室，山东济南250014)

雷帕霉素靶蛋白(TOR)是存在于真核生物中的一类非常保守的脯氨酸调控的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族，属于磷酸肌醇相关激酶(PIKKs)家族成员［1-2］.20世纪90年代，科学家首先在酵母菌中发现两种雷帕霉素的靶蛋白TOR1和TOR2［3］.1994年，Brown等在哺乳动物细胞内发现了TOR1和TOR2的同源基因，命名为mTOR［4］.酵母TOR激酶分子和mTOR分子均由由5个功能区域构成，从氨基端开始依次为:约20个串联的HEAT重复序列、中心区的FAT域、靠近羧基端的FRB域、激酶域和FATC域［5-7］.

TOR作为一种重要的调节基因通过调节细胞周期、蛋白质合成、细胞能量代谢等多种途径发挥重要的生理功能，在细胞的增殖、生长、分化过程中起着中心调控点的作用［1-2］.在酵母及哺乳动物细胞中，TOR的调节作用主要通过TORC1和TORC2两组TOR复合物完成.其中，TORC1主要调控由生长因子、能量、营养、逆境等引起的细胞生长方面的变化，如RNA翻译、蛋白质合成等;TORC2主要对形成细胞骨架的肌动蛋白起调控作用.

植物的生长和发育具有很强的可塑性，其形态及器官会因环境的变化发生很大的变化.因此，TOR在植物生长发育中所起的作用也越来越受到关注.2002年，法国科学家Menand等［8］在拟南芥中找到了TOR的同源基因，命名为AtTOR(At1g 50030).AtTOR由2 481个氨基酸组成，相对分子质量为279000，也含有mTOR和酵母TOR所包含的几个结构域，其中FRB位于1930－2022，激酶域位于2092－2340，FATC位于2451－2481［8］.

拟南芥TOR突变体纯合子无法完成生活史，在胚胎时期就已致死［8］.在AtTOR完全被敲除掉的纯合子中，虽然胚细胞也可进行细胞分裂，但却不正常，胚无法形成极性的胚轴.不仅如此，纯合子在胚乳的发育上也有缺陷［8］.由此可见，植物的TOR对其生长发育起着举足轻重的作用.Deprost等［9］发现，当拟南芥体内的AtTOR表达下调时，多聚核糖体的积累将大大减少.从这个角度来说，AtTOR在调控蛋白质的合成上，起了一定的作用.

作为一种新型的模式植物，盐芥具有许多优点:个体小，生长周期较短，自花授粉，种子数目多，基因组也不大［10-12］，仅为拟南芥的两倍.除此之外，盐芥对各种非生物胁迫的耐受能力远远强于拟南芥.盐芥cDNA和蛋白的表达与拟南芥的同源性很高，分别为90%和95%［10，13］.本实验利用分子生物学方法克隆得到盐芥TOR基因(ThTOR)，并进行了初步研究.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

盐芥(Thellungiella halophila)种子采自山东东营，植株为山东师范大学逆境植物重点实验室自行种植.

1.1.2 菌种与质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株为山东师范大学逆境植物重点实验室保存.

pMD18-T载体为TaKaRa公司产品;pBluescript KS和pCAMBIA3301质粒为山东师范大学逆境植物重点实验室保存，pRT101-INT4为山东师范大学逆境植物重点实验室孙伟老师改造，用于构建RNA干扰(RNAi)框架.

1.1.3 主要培养基与培养条件

LB液体培养基(含相应抗生素)用于培养各种重组菌及DH5α、GV3101等菌株［14］.DH5α的摇床培养条件为37℃、220 r/min;GV3101的摇床培养条件为28℃、220 r/min.

LB固体培养基(含相应抗生素)用于培养重组大肠杆菌和农杆菌［14］.DH5α的培养条件为37℃恒温培养箱过夜培养，GV3101的培养条件为28℃恒温培养箱培养48h.

1.1.4 主要酶及试剂

TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、反转录试剂盒及RACE试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司及INVITROGEN公司，其它试剂和药品为市售分析纯.

1.2 方法

1.2.1 盐芥总RNA的提取及反转录

取盐芥的新鲜叶片，用Trizol法抽提RNA，分别以3'端引物和Oligo dT18为引物按宝生物工程有限公司反转录试剂盒说明书进行互补DNA(cDNA)第1条链的合成.

1.2.2 盐芥TOR基因cDNA序列的获得

表1 克隆ThTOR基因cDNA保守区所用的兼并引物序列Table 1 Degenerate primer sequences used in the cloning of ThTOR cDNA conservative regions

表2 其它克隆ThTOR基因cDNA所用的引物序列Table 2 Other primer sequences used in the cloning of ThTOR cDNA

依据Genbank数据库中已知的植物TOR家族的蛋白保守区域，尤其是盐芥近缘物种拟南芥的基因序列设计扩增兼并引物(见表1)，以反转录获得的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增盐芥TOR的保守片段.经克隆测序后以保守区序列为模板设计引物(见表2)，扩增盐芥TOR的非保守区.通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得盐芥TOR的两端序列，3'RACE按照宝生物工程公司试剂盒要求进行，5'RACE按照INVITROGEN公司5'RACE试剂盒进行.两次RACE的扩增产物测序后，与其它序列拼接后获得ThTORcDNA的全长序列.

1.2.3 盐芥TOR基因全长序列的获得

采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取盐芥新鲜叶片的基因组DNA，根据已获得的ThTORcDNA的开放阅读框(ORF)设计引物(见表3).使用宝生物工程公司的DNA聚合酶(Pyrobest®DNA Polymerase)，具体方法参照宝生物工程公司说明书.PCR产物经凝胶回收纯化后与pBluescript KS载体连接，转化DH5α感受态细胞后进行测序.将所有测序所得序列拼接后获得盐芥TOR基因组(ThTOR)的全长序列.

表3 克隆ThTOR基因组所用引物序列Tabal 3 Primer sequences used in the cloning of ThTOR genomic

1.2.4 盐芥TOR转基因沉默株系的获得

选择ThTOR基因FAT域约450 bp的特异性强的序列设计引物，用于构建盐芥TORRNA干扰沉默载体(ThTOR-RNAi).在引物序列中引入合适的酶切位点，正向引物为5'TGAATTCTTTACCGTTTGATCCAGAAGTATCAC3'，反向引物为5'ATATCCCGGGACTGCAGAAACAACG3'.以pRT101-INT4载体为中间载体构建RNAi表达框架(见图1)，成功后，再用合适的酶克隆到植物表达载体pCAMBIA3301上.构建成功的ThTOR-RNAi植物表达载体转化农杆菌GV3101，挑取阳性克隆，利用花浸染法转化盐芥.

图1 ThTOR-RNAi框架Fig.1 Frame of the ThTOR-RNAi

T0幼苗出苗2～3周后，用0.1%(体积分数)的Basta喷洒筛选，转基因植株由于具有除草剂抗性得以存活.用改良CTAB法提取抗性植株的叶片总DNA，以ThTOR基因沉默表达载体DNA为阳性对照，野生型植株和无菌双蒸水为阴性对照，对基因沉默的目的片段进行PCR检测.PCR检测阳性的抗性植株为转基因株系.

1.2.5 盐芥TOR转基因沉默株系的性状分析

将转基因株系用实时定量PCR的方法进一步确定ThTOR在沉默株系中的表达量.根据ThTOR的cDNA全长序列设计特异正向引物5'TCAATGAAGTCCCTCAATTAGCCTTGCTTG3'和反向引物5'CCAAGCATATTCACAGCCTGAAGAATTTCC3'.分析中选用表达相对稳定的盐芥肌动蛋白7的基因(actin7)作为内标基因.根据基因的保守序列(从山东师范大学逆境植物重点实验室盐芥cDNA文库获得)设计正向引物5'AAATACAGTGTCTGGATCGGAGGATCTATC3'和反向引物5'TAACAAACTCACCACCACGAACAAGAGAAG3'.

本实验采用的实时定量PCR方法是相对定量方法，是使用内源性的对照来校正样品的加样量，通过与对照样品相比较计算未知样品的量.PCR反应中，在其它参数恒定的反应条件下，产物开始进入指数期增长的循环数(CT)只与反应体系中原始模板的量有关，通过2－ΔΔCT计算将统计数据转化成线性形式.其中ΔCT表示目标基因和内标基因CT值的差异，ΔΔCT表示纠正过加样误差后不同处理株系与对照株系目标基因CT值的差异，2－ΔΔCT则表示不同处理株系与对照株系目标基因表达的相对变化.根据定义，对照株系中目标基因的表达量为1，而相对于对照株系，处理株系中目标基因表达的倍数为2－ΔΔCT.

根据检测结果，选用ThTOR基因表达量下调的株系.将野生型盐芥种子与转基因盐芥种子同时用水浸泡于4℃2～3周，取出均匀播种于培养土(育苗介质、蛭石、珍珠岩体积比为4∶3∶1)中，温度为18～22℃，16h光照，8h黑暗.植株生长至有4－6片真叶时，将其移入装满培养土直径约7 cm的小盆中.

2 结果与分析

2.1 ThTOR cDNA全长的克隆与分析

以盐芥cDNA为模板，分别用保守区兼并引物及非保守区引物(如表1、2所示)进行PCR反应，将PCR产物回收克隆后进行测序，通过序列拼接获得含有一个完整编码区的基因序列，命名为ThTOR，Genbank登录号为HQ420260.所获得的ThTOR基因的cDNA全长7836bp，ORF为7437 bp，5'非编码区为196bp，3'非编码区为203 bp，与拟南芥TORcDNA的同源性高于95%.全序列的第197－199个碱基编码起始密码子M，7634－7636处的TGA为终止密码子，编码2 479个氨基酸，相对分子质量为279000.

2.2 ThTOR基因组全长的克隆与分析

以盐芥基因组DNA为模板，用表3中的引物进行PCR扩增，得到的特异条带经测序后拼接得到ThTOR基因组序列全长.ThTOR基因组DNA长度为19162bp，其中有55段内含子和56段外显子，Genbank登录号为HQ420259.拟南芥AtTOR基因组DNA长度为17555 bp，比盐芥少了约2 kbp，但其外显子片段个数与盐芥相同.盐芥与拟南芥外显子在DNA序列中的位置比较如表4所示.由表4可以看出，内含子及外显子的分布在拟南芥及盐芥中都较为均匀，没有较大差异.

2.3 ThTOR推导的蛋白序列的分析

ThTOR蛋白序列由2 479个氨基酸组成，经过分析发现，ThTOR与AtTOR的蛋白序列仅有63个氨基酸发生变化，同源性高达97.5%.表5示出了ThTOR与AtTOR中差异氨基酸的位置及其突变类型.ThTOR具有TOR基本的结构域，FAT域位于第1309－1887个氨基酸;FRB域位于第1920－2023个氨基酸;激酶域位于第2 090－2 340个氨基酸;FATC位于第2447－2479个氨基酸.

表4 盐芥ThTOR与拟南芥AtTOR外显子位置的比较Table 4 Exon location comparison between ThTOR and AtTOR

2.4 ThTOR-RNAi转基因株系的获得与鉴定

2.4.1 盐芥ThTOR-RNAi植物表达载体的构建

由PCR获得用于RNAi的ThTOR基因片段(约450bp)，测序后与已获得的ThTORcDNA进行比对，结果完全一致.

将构建好的ThTOR-RNAi表达框架克隆入植物表达载体，重组质粒命名为3301-THCM.

2.4.2 盐芥ThTOR-RNAi转基因株系的鉴定

提取Basta初步筛选的抗性植株的DNA，用PCR方法对ThTOR基因的RNAi片段进行检测，检测结果为阳性即证明抗性植株中已成功转入RNAi表达框架，PCR检测结果见图2.水阴性对照及野生型盐芥中均未扩增出ThTOR-RNAi片段，而转基因植株中均扩增出与阳性对照大小一致的片段.

表5 ThTOR与AtTOR差异氨基酸的比较Fig.5 Comparison of differentamino acids between ThTOR and AtTOR

图2 部分转基因株系的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of some transgenic plants

2.5 盐芥ThTOR-RNAi转基因株系ThTOR基因的表达及表型分析

图3 ThTOR-RNAi转基因植株与野生型植株的生长情况Fig.3 Growth of wild type and the ThTOR-RNAi transgenic plants

图4 ThTOR-RNAi转基因植株与野生型植株果荚的生长情况Fig.4 Infruit development of wild type and the ThTOR-RNAi transgenic plants

2.5.1 盐芥ThTOR-RNAi转基因株系中ThTOR基因的表达分析

本实验把野生型盐芥(wt)作为对照样品(本研究中所有检测及照片涉及到的野生型均为同一株系).通过实时定量PCR，共对3个转基因沉默株系ThI1、ThI5、ThI6的mRNA表达水平进行了分析.野生型和转基因株系ThI1、ThI5、ThI6的2－ΔΔCT值分别为1、0.8060、0.5873、0.7457.可见，3个转基因沉默株系的ThTOR表达水平均有不同程度的降低.其中，ThI5和ThI6降低更为显著.

2.5.2ThTOR对盐芥的生长及果荚发育的影响

根据实时定量PCR的分析结果，选取ThTOR下调明显的ThI5和ThI6与生长发育时间一致的同一株野生型盐芥相比，见图3、4.由图3可知，ThTOR基因沉默株系的生长明显缓慢，野生型盐芥种子已处于成熟状态，而转基因沉默株系仅处于抽苔前期.由图4可知，ThI5和ThI6这两个株系的盐芥植株的果荚有明显败育现象.跟野生型相比，ThTOR基因沉默盐芥春化开花后，无法正常形成果荚，或形成的果荚发育不全，不饱满，种子数量也远远小于野生型.

3 结论

AtTOR和ThTOR的蛋白序列同源性很高，达97.5%，cDNA序列的同源性也高于95%.结果表明，尽管ThTOR的基因组序列比AtTOR的基因组序列多了近2 kbp，但两个物种的内含子及外显子分布都较为均匀，没有明显的差异.ThTOR基因沉默株系具有明显的生长迟缓和败育的现象.说明ThTOR

对盐芥的生长发育，尤其是盐芥的生殖器官，起重要作用.这一现象与拟南芥的研究结果相一致.

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