真菌胞内多糖提取方法的研究进展

阿燕

(包头轻工职业技术学院乳品工程系，内蒙古包头014035)

真菌多糖系真菌中分离出的由10个以上的单糖以糖苷键连接而成的不溶于高浓度乙醇、正丁醇及丙酮等有机溶剂的高分子聚合物，是从真菌子实体、菌丝体及发酵液中分离出的代谢产物。大量药理实验表明，真菌多糖可以消除体内的自由基，具有抗氧化性，因而具有免疫调节、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，己被广泛应用于医疗保健领域［1］。到目前为止，已有300余种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从中草药、食药用菌中提取的水溶性多糖最为重要。专家预测，随着对多糖结构和功能关系的研究，将会产生生物学的新领域，促进医学上的高速发展和工农业上新的应用［2］。国内外在真菌多糖的研究及开发利用方面的进展很快，其中真菌多糖的提取是研究与应用的基础。真菌多糖的提取过程就是使之从细胞内释放、穿过基质、扩散到溶剂中的过程。本文对近年来国内外报道的有关真菌胞内多糖(菌丝体多糖和子实体多糖)的提取方法进行了概述，总结了几种提取方法的优势与不足，为真菌多糖的提取应用提供参考。

1 热水浸提法

大多数真菌多糖可溶于水，在热水中呈黏液状，在乙醇等有机溶剂中形成沉淀，因此热水提取法是目前最常用的提取真菌多糖的方法。用热水进行提取，主要是借助于热力作用使食用菌细胞发生质壁分离，水作为溶剂渗入细胞壁和细胞质中，溶解液泡中的物质，使其穿过细胞壁，扩散到外部溶剂中［3］。史琦云等［4］总结归纳了食用菌多糖提取工艺流程：原料→烘干至恒重→粉碎→准确称量→复水→热水浸提→离心分离→上清液脱色→去除蛋白质→醇析→离心→干燥→菌多糖成品。

随着生物学与统计学、计算机科学等学科的交叉发展，目前一些统计学的设计方法和数据分析法已经广泛应用于真菌胞内多糖提取，其中最常见的有正交试验设计和Box-Behnken中心组合实验设计。陈凌华等［5］对灵芝多糖热水浸提过程中浸提的温度、时间及料水比3个因素进行正交试验，结果表明，浸提温度对多糖得率的影响较大。灵芝多糖热水浸提的优化条件：温度78℃，料水比1∶30(g/mL)，提取时间3 h，在此条件下单次浸提即可获得绝大部分的子实体多糖。魏桢元等［6］以浸提时间、浸提温度和料液比为影响因素，在单因素实验的基础上，应用Box-Behnken中心组合实验方法进行3因素3水平的实验设计，结果表明，热水浸提香菇多糖的最佳工艺条件：浸提温度78.6℃，浸提时间120 min，料液比1∶58.3(g/mL)，在此条件下的多糖得率和含量分别为14.22%和38.57%。热水浸提法的优点为试验设备简单，操作方便，提取成本低，适用于大规模的工业生产，但此法存在的不足是需经多次浸提，而且费时费料，劳动强度大，过长的浸提时间还会破坏多糖的结构，进而导致其生物活性的降低。

随着工业技术的发展，一些改进的热水浸提法开始应用于真菌多糖的提取。刘美娜等［7］利用加压水提法对黑木耳子实体多糖提取过程进行了优化，得出子实体多糖的最佳条件：浸提时间为90 min，料水比为1∶35(g/mL)，浸提温度为115℃，提取率7.1 g/100 g。结果表明，在浸提时间、温度、料水比相同的条件下，加压水提法的多糖提取率较高，升高压力有利于缩短提取时间，且对多糖本身没有破坏作用，相比热水浸提法有利于保持多糖的稳定性，防止多糖在提取的过程中发生水解，也可以防止多糖失活。

亚临界水提法也是当前兴起的一种多糖提取方法，所谓亚临界水也被称为过热水、高压热水或热液态水。当水在374.2℃和22.1 MPa以上的高温、高压条件下，可形成既非液体又非气体的第4状态，即所谓“超临界状态”。在此状态下的水称为“超临界水”。在稍微低于此温度和压力下的水称为“亚临界水”［8］。娄冠群等［9］采用亚临界水技术提取香菇子实体多糖，结果表明，最佳提取条件为亚临界水温度150℃，料液比1∶30(g/mL)，浸提时间为5 min，浸提次数为2次，在该条件下香菇多糖得率可达15.7%，与热水浸提法香菇多糖得率9.34%相比有很大提高，这是因为亚临界水具有“强烈的溶解有机物在水中”和“强烈的分解力”等普通水不具有的性质;亚临界水法的液料比小于热水浸提法，这使提取液中香菇多糖的浓度增大，为后续浓缩和纯化提供了方便。亚临界水提取香菇多糖比热水浸提法省时节能，具有较高的效率，实际生产中有较高的使用价值。

2 酸提法

酸提法一般适用于酸溶性多糖的提取，但时间宜短，温度不宜过高。吴亚林等［10］采用0.05 mol/L的醋酸缓冲液(pH=6.0)提取冬虫夏草菌丝体多糖，得率为1.84%。郝强［11］采用酸浸提法提取香菇多糖，以酸浓度、料液比、浸提时间、浸提温度和加醇比为影响因素，通过五元二次回归通用旋转组合设计，确定出优化的主要工艺条件是酸浓度0.16～0.23 mol/L、料液比1∶36～1∶49(g/mL)、浸提时间2.7～3.8 h、浸提温度50～67.8℃、加醇比1∶2～1∶3，4℃醇沉12 h。浸提1次提取多糖得率为7.61%，浸提2次提取多糖得率可达13.56%。五元二次正交旋转组合试验表明，5个因素对多糖提取率影响大小依次为浸提温度、料液比、酸的浓度、浸提时间、加醇比，其中浸提温度、料液比、酸的浓度、浸提时间呈现显著性，而加醇比呈现不显著。由于酸提法对多糖的糖苷键具有一定的破坏作用，降低多糖的提取率，因此，采用酸提法时，应选择适宜浓度的酸溶液，以防止多糖的降解。

3 碱提法

碱提法一般适用于碱溶性多糖的提取，碱液能够使真菌细胞和细胞壁充分吸水胀膨而破裂，从而促进真菌多糖的释放，提高多糖提取率。陈建旭等［12］以赤灵芝为原料提取碱溶性多糖，比较了浸提时间、温度、NaOH浓度、液料比及提取次数对碱溶性多糖提取率的影响，并以浸提时间、温度、NaOH浓度以及液料比为考察因素，采用RSA响应面分析法，确定了碱溶性多糖提取的最佳工艺参数，即液料比20 mL/g，浸提温度60℃，浸提时间2 h，NaOH质量浓度5%，在此优化工艺条件下，碱溶性多糖提取率为19.61%。刘华晶等［13］提取蛹虫草菌丝体粗多糖时，用水和碱溶液2种溶剂分别进行提取试验，利用正交旋转设计软件包计算从而找到多糖最佳提取条件，结果表明利用碱溶液进行提取所得多糖产量显著高于水提取法。由此可见，采用碱提法提取真菌胞内多糖具有提取效率高、能耗少、时间短等优点，但是碱提后的溶液浓度增大，还需中和，后处理程序繁琐。

4 酶提法

酶提法是通过酶反应将原料组织分解，以除去细胞壁和膜上的果胶、纤维素及蛋白质等成分，从而降低提取难度，有利于细胞壁内多糖的溶出，使多糖提出率提高［14］。酶解法的一般方法为按一定料液比加入样品干粉和生物酶、蒸馏水，在合适温度和pH值下酶解一定时间，然后升温灭酶，在合适的温度下提取一定时间，离心取上清液，即可测定多糖含量［15］。由于真菌细胞壁成分复杂，而且不同的真菌细胞壁成分不同，单一酶法往往不能充分释放胞内多糖，因此实际应用中多采用复合酶法，利用各种酶协同作用，充分破坏菌体细胞结构，最大限度提高多糖的提取率。

如对红蘑子实体多糖的酶法提取研究，采用单因素与正交试验相结合，优化复合酶法提取红蘑中的粗多糖工艺，其最优提取条件酶解3 h、酶解温度60℃、纤维素酶和木瓜蛋白酶的比例3∶1(质量比)、pH 5.0，粗多糖得率可达12.0%，与热水浸提红蘑子实体多糖得率8%相比，提取率有了较大的提高［16］。张帅等［17］比较了复合酶法与热水浸提和酸、碱浸提法在猴头菇子实体多糖提取率的差别，结果表明复合酶法浸提可大大提高可溶性多糖的浸提率，在2 h内，其多糖浸提率可达4.46%，分别是热水浸提和酸、碱浸提法的1.7、1.3和1.5倍。因此，酶提法不仅可以使多糖的得率大幅度增加，还具有提取条件温和、提取时间短、对多糖损伤小、杂质易除等优点;不足之处是酶的价格较高，又容易失活，实验过程中温度控制要求严格(因酶的最佳温度在很小的范围内，条件的改变可能导致酶的失活)，且多糖的高级结构可能因酶的作用而改变［18］。

5 超声波辅助提取法

超声波辅助提取多糖是利用超声波空化产生的极大压力造成真菌细胞壁及整个生物体破裂，同时超声波产生的刺激效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速真菌胞内多糖的释放、扩散及溶解，因而能很好地提高多糖的提取率。陈小平等［19］利用超声波辅助法提取林芝胞内多糖，在单因素实验的基础上，通过响应面分析法优化林芝多糖的提取工艺，在最优化提取条件下林芝多糖的得率由优化前的42%提高到75%。胡斌杰等［20］利用超声波辅助法对灵芝多糖的提取工艺进行了研究，同时比较了超声波提取法与热水浸提法、稀酸浸提、稀碱浸提在灵芝子实体多糖提取率上的差别，结果表明超声波最佳提取条件：药材粒度20目，提取温度55℃，超声处理时间20 min，料液比1∶20;超声提取方法比常规提取方法具有更大优势，提取时间大大缩短，提取含量比热水浸提、稀酸浸提、稀碱浸提法分别提高了36.17%、45.45%、39.13%，提取过程温度也较低，避免了高温对灵芝多糖分子结构的分解。由此可见，超声波辅助法具有提取效率高、提取时间短、提取温度低、多糖结构稳定等优点，但是超声辅助提取时间不宜过长，否则会造成糖苷键的断裂而导致提取率降低。

鉴于超声波辅助提取法存在的不足，有关学者提出超声波结合酶法提取真菌多糖，谢丽源等［21］利用超声波复合酶法提取桑黄菌丝体多糖，得出超声波提取优化工艺条件为超声处理时间20 min、料液比1∶25(g/mL)、功率500 W，在此基础上提取多糖得率为3.356%，在超声波优化结果基础上，进一步进行复合酶法处理，酶解最佳提取条件是pH 6.5，酶解温度50℃，纤维素酶添加量2.5%、果胶酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%，酶解时间120 min，多糖得率为6.619%。由此可见，超声波辅助酶法较单一超声波提取真菌多糖有更好的效果，原因可能是超声波虽然能增加对真菌细胞壁的破碎效果，增加多糖溶出率，但是它不能完全地将细胞壁破碎，而酶的加入正好弥补这一缺陷，对细胞壁进一步的酶解，充分释放胞内多糖。

6 微波辅助提取法

微波法是靠微波电子管发出的电磁波，感应生电，又转化成分子的动能而发热，从而导致细胞内的极性物质，尤其是水分子，产生大量热量，使得细胞内的温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减小，细胞收缩，表面出现裂纹。由于孔洞和裂纹的存在，胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放胞内多糖［14］。宋江峰等［22］考察了微波功率、液固比、浸提时间、提取次数等单因素对蛹虫草多糖得率的影响，得出蛹虫草子实体多糖微波提取最佳工艺参数：微波功率744.795 W，提取时间4.25 min，液固比31.057 mL/g，结果表明微波辅助提取较水提法提取时间大大缩短，节约用水量，并获得理想的萃取效果。

目前也有不少学者将微波辅助提取法同超声波辅助提取法、热水浸提法进行了比较研究，如时东方等［23］分别采用热水浸提法、微波辅助提取法和超声提取法提取桑黄菌丝体粗多糖，结果表明，微波辅助法与热水浸提法相比，时间大大缩短，提取率是其2倍;与超声提取法相比，只用一半的时间，提取率提高40%。因此，微波辅助提取法的提取效率最高，与传统的热水浸提法相比，微波提取技术主要特点是快速、节能、节省溶剂、污染小而且有利于萃取热不稳定的物质，可避免长时间的高温引起的物质分解，特别适用于处理热敏性组织成分或从天然物质中提取有效成分［24］;与超声波辅助提取法相比，微波虽然在提取率方面优于超声波辅助法，但是微波法有其局限性，即不适于大批量的工业生产，仅适合实验室研究，稍高的提取功率都有可能会破坏真菌多糖结构，导致生物活性的降低，而超声提取法的全过程不需高温，避免了因高温对多糖分子结构的破坏，超声波仪自动化程度更高，适合大规模工业生产。

为了在微波辅助法的基础上更进一步提高多糖的提取率，超声波-微波协同萃取被不少学者应用于真菌胞内多糖的提取。周明等［25］采用超声波-微波协同萃取灵芝子实体多糖，结果表明，超声波-微波协同萃取法与常规热水提取工艺相比，可减少3/4的提取时间、提高26.27%的提取效率，同时还能有效降低用水量，节约水资源。黄生权等［26］采用响应面优化超声-微波协同萃取法提取灵芝子实体多糖，结果表明超声-微波协同萃取最佳的提取工艺条件为原料用量100 g，微波功率284 W，提取时间12 min，料液比1∶11.6(g/mL);与传统水浴浸提法相比，超声-微波协同萃取法在较短的超声提取时间下，灵芝多糖的提取率从1.517%提高到了3.27%。超声-微波协同萃取法提高了真菌多糖提取率，可能是由于微波的破壁效应、热效应，超声波的机械振动作用、空化作用，以及微波和超声波的协同作用，使得真菌细胞内的多糖成分可以更好地释放、进入溶剂并充分混合，从而提高提取率。

除了上述6种常用的真菌胞内多糖的提取方法外，目前文献报道的还有超临界萃取法、膜分离提取法、真空气流破壁提取法等多种提取方法。根据某些气体在超临界状态下具有特殊的液相性质，对一些组分有较好的溶解性，用来提取目的产物。一般采用CO2超临界萃取多糖组分［27］，这种方法对物质的生物活性保存较好，但成本较高，大多用于价值较高的多糖的提取。膜分离提取法主要是根据膜的选择透过性来分离浓缩真菌胞内多糖的，但是膜分离提取法由于操作流程复杂和成本高，因此不常用。化学渗透法主要是利用化学药品改变细胞壁或膜的通透性，从而使胞内多糖有选择地渗透出来，但鉴于化学试剂的危害性，目前较少采用。

7 展望

国内外已从高等担子菌中筛选到200多种有生物活性的多糖物质，目前市场上投放的真菌多糖类保健品已有上百种之多［28］。真菌多糖可应用于人类的疾病治疗和保健，对其提取分离工艺的研究可促进食用真菌和药用真菌的深加工与进一步开发，但是国内外对真菌多糖的高级结构、合成途径、药理学机理以及结构与功能的关系研究的不够深入，因此，有必要在这些方面加大科研投入力度，同时还应该扩大真菌多糖的应用领域，充分挖掘真菌多糖的应用潜能。

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