454测序技术在微生物生态学研究中的应用

段曌，肖炜，王永霞，赖泳红，崔晓龙

(云南大学云南省微生物研究所，云南昆明650091)

微生物生态学是研究微生物与其周围的生物及非生物环境的相互作用规律的学科。传统的微生物生态学研究是基于微生物的直接培养来分析环境中微生物的种群结构及其生态关系的，微生物纯培养及显微技术作为鉴定微生物种群的手段有很大的局限性，因为环境中大多数微生物处于“存活但不能培养”(viable but nonculturable，VBNC)的状态［1］。因此，不依赖于微生物纯培养的分子生物学方法正被广泛地用于微生物生态学研究，即微生物分子生态学。20世纪90年代以来，微生物分子生态学技术层出不穷，大大加速了微生物生态学的发展。近年来，第2代测序技术的出现使得微生物生态学的研究更加深入和便捷。以Sanger法(双脱氧核苷酸末端终止法)为代表的第1代测序技术帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组的大量测序工作，但由于其成本高、速度慢、通量低等不足，已不能满足后基因组时代的测序要求［2］。因此，第2代测序技术应运而生。第2代测序技术主要包括454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台［3］。目前，在微生物生态学研究中应用最广泛的是GS FLX测序平台。这种高通量低成本的测序方法为环境微生物多样性研究提供了新的手段，大大推动了环境基因组研究的快速发展，使得大规模的环境基因组研究相继展开，大量的新的微生物种群和新的基因得以发现。应用454测序技术的研究论文每月数以百计地发表，本文结合本实验室的研究成果，对近年来运用454测序技术在微生物生态学研究中的进展进行综述，并对其研究前景进行介绍。

1 454测序技术原理

GS FLX系统的测序流程概括起来就是“1个片段=1个磁珠=1条读长(One fragment=One bead=One read)”。特别设计的DNA捕获磁珠与独特的短的DNA片段结合，并被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含1个磁珠和1个独特片段的微反应器。每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。携带短的PCR产物片段的捕获磁珠随后放入只能容纳1个磁珠的PTP板中进行测序。放置在4个单独的试剂瓶里的4种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入1个碱基。如果发生碱基配对，就会释放1个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素酶的作用下，释放出光信号，并实时地被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有1个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号，由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。GS FLX系统在10 h的运行当中可获得100多万个读长，读取超过4～6亿个碱基信息。除GS FLX系统提供的生物信息学工具外，目前也有很多程序包和数据库可用于大规模测序数据的分析，如CAMERA［4］、Mothur［5］、FastUnifac［6］等。

2 454测序技术在环境微生物多样性研究中的应用

454测序技术适于对短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger测序法相媲美，而速度和数据量却大大提高，无需文库构建，没有克隆的误差，能最大程度地节约人力、物力。目前，该技术在土壤、海洋、活性污泥、废水、食品、化妆品、矿井和盐湖等环境微生物多样性研究中都有应用。

2.1 454测序技术在土壤微生物多样性研究中的应用

土壤由固体、液体和气体3类物质组成，土壤微生物一般包括细菌、真菌、藻类、原生动物、病毒及类病毒。土壤微生物种类和数量随成土环境及土层深度的不同而变化。Roesch等［7］利用454技术研究了位于西半球一个横断面的4类土壤中微生物的多样性，结果显示，这4类土壤中，最丰富的微生物类群是拟杆菌门(Bacteroidetes)、α-变形菌门和β-变形菌门。与农业土壤相比，森林土壤的微生物多样性更为丰富，然而森林土壤中的古菌多样性较少。此研究证实，是否采取农业化管理对于土壤中古菌和细菌多样性的影响是显著的。这一结论也得到了Campbell等的证实。Campbell［8］的研究表明，长期施肥的北极冻土带土壤微生物不仅多样性较低，而且被其利用的营养物质也会发生变化，这与土壤中所含碳氮的可利用性以及表层植物的变化有关。除了应用于原核生物的研究，Lim等［9］也应用454技术研究韩国黄海3个岛屿的土壤真菌多样性。他们不仅发现此前未知的土壤真菌丰富的多样性，还证明454测序技术也适于土壤真菌多样性的研究。同样，454测序技术在功能微生物的研究中也表现出巨大的应用价值。例如研究含高CO2土壤里微生物群落的结构及功能［10］以及农用土壤里氨单加氧酶基因(amoA)丰度［11］。这些研究更深刻地揭示了功能微生物在土壤生态系统中的重要作用。由此可见，应用454测序技术对土壤微生物的研究大大扩展了对土壤微生物多样性的认识，大量未知的微生物及其在土壤中的功能得以了解，周围土壤环境对微生物的影响作用得以证实，随着454技术的发展，该技术在土壤微生物多样性研究中将会起到越来越重要的作用。

2.2 454测序技术在海洋微生物多样性研究中的应用

海洋堪称为地球上最庞大的恒化器，能承受巨大的冲击(如污染)而仍保持其生命力和生产力，而微生物是其中不可缺少的活跃因素。尽管海洋中存在着丰富的微生物，但是研究手段的限制成为当代海洋微生物学研究和海洋资源开发的障碍。所以，近几年，许多科学家开始采用高通量测序法来研究海洋微生物。Sogin等［12］检测深海和未探索的稀有生物圈(rare biosphere)，即位于大西洋东部海山中轴热泉中的微生物多样性。454测序结果显示，大西洋海底和热泉中的微生物比以前报道的数量要高1～2个数量级，并且微生物类群也比以前报道的要复杂得多。此未探索的稀有生物圈中的微生物是非常古老的，它们不仅可以提供新的基因组数据，在地球历史的不同时期，还对地球的演变进程产生过深刻的影响。Hube等［13］研究两邻近深海热泉中微生物多样性和种群结构，检测到了许多细菌新类群，结果表明，这2眼热泉微生物种群结构的不同与当地的地理情况相关。由此说明获取成千上万条序列是有必要的，这将极大地促进海洋微生物资源的开发。作为海洋生态系统的重要组分，珊瑚的健康向来受到研究者的关注。Gaidos等［14］采用454测序法，研究夏威夷岛深海珊瑚礁微生物的群落空间结构及其多样性，发现最丰富的细菌类群是变形菌门、厚壁菌门、放线菌门，最丰富的古菌类群是亚硝化侏儒菌目(Nitrosopumilales)、广古菌门(Euryarchaeota)、泉古菌门(Crenarchaeota)。针对珊瑚礁与微生物之间的关系，Elizabeth［15］研究位于莱恩群岛北部的4个环状珊瑚礁岛的微生物多样性，分析微生物对珊瑚礁的影响作用。发现微生物对珊瑚礁的生态系统功能具有显著影响，是维持珊瑚健康生长的一个重要因素。

Dos Santos等［16］为研究石油对红树林沉积物中微生物多样性的影响作用，模拟石油泄漏，污染红树林沉淀物，然后进行454测序。结果显示，污染前后相比，污染后的红树林沉积物中微生物类群明显较多，而γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)都广泛存在。污染后的红树林沉积物中，Chromatiales和Haliea的数量减少2%～5%，海杆菌属(Marinobacter)、海细菌属(Marinobacterium)和解环菌属(Cycloclasticus)的数量增多，该结果暗示，这些微生物都可以作为石油污染的生物监测指标。

除了原核生物，海洋中还含有数量巨大，多种多样的病毒。Angly［17］对从4大洋的68个样点采集到的样品进行454测序，分析得到了184个病毒群，这些病毒是典型的海洋病毒系，具有丰富的多样性，与现有数据库中的病毒序列并不相似。病毒总体的多样性非常高，大概有成百上千个物种，而且区域丰度随着南北纬度而变化。

海洋微生物资源是一个十分巨大的有待深入开发的资源库，采用高通量深度测序将提供更多的海洋微生物信息，这些信息在第2代测序技术出现前是很难获得的，这为今后的海洋资源开发和持续利用奠定良好的基础。

2.3 454测序技术在沼气发酵和活性污泥微生物研究中的应用

沼气是可再生的清洁能源，既可替代秸秆、薪柴等传统生物质能源，也可替代煤炭等商品能源，而且能源效率明显高于秸秆、薪柴、煤炭等。早在18世纪科学家们就开始研究沼气了，对于发酵沼气的微生物研究也越来越多。Jaenicke等［18］采用第2代454测序系统分析沼气发酵罐中微生物的多样性，检测出之前未出现的Streptococcus(链球菌属)、Acetivibrio(醋弧菌属)、Garciella、Tissierella(泰氏菌属)和Gelria，它们在发酵罐中对于沼气的形成起着重要作用。与之前采用第1代454测序系统研究沼气发酵罐中微生物的多样性结果相比，采用新1代454测序技术可以获得更多的微生物组成信息。由于454测序技术的惊人发展速度，同样的样品进行多次分析，可以提供更为丰富的结果。

活性污泥(active sludge)是微生物群体及它们所依附的有机物质和无机物质的总称。Sanapareddy［19］对废水处理厂的活性污泥提取的总DNA进行454测序，这些序列只有0.3%组装成有意义的重叠群。猜测其中117个大于500 bp的重叠群可能为转座酶和蛋白。通过将所得的序列与已知微生物基因组进行比较，得知污水处理厂中的绝大多数微生物与先前描述的分类单元亲缘关系较远。Kwon等［20］运用同样的测序技术研究污水的悬浮样本和IFAS system(Integrated fixed-film activated sludge system，集成固定膜活性污泥体系)膜上的微生物组成和多样性。比较发现，悬浮样本中最丰富的微生物类群是β-变形菌纲、γ-变形菌纲、拟杆菌门等，而FAS system膜上样本中最丰富的微生物类群是放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等，系统发育表明样本中微生物大都为稀有物种。这些研究中获得的信息将为以后关于活性污泥微生物群落结构的研究以及对IFAS系统功能的了解奠定基础。

2.4 454测序技术在食品和化妆品微生物中的应用

随着454测序技术的成熟，该技术的运用范围越来越广。Li等［21］采用454测序技术研究中国传统酒发酵过程中的细菌与真菌的多样性。检测到的细菌分属于15个科，多于91%的16S rRNA基因序列归属于乳酸杆菌科;真菌分属于6个科，60%的真菌ITS1(Internal transcribed spacer region 1)序列归属于酵母科。Lopez-Velasco等［22］采用454测序技术，研究菠菜在冷藏前后所含微生物的变化。得知菠菜冷藏后包含了许多与冷藏前不同的微生物类群，冷藏后微生物群落的丰富性、多样性、均一度都降低。Telias［23］采用2种不同的水资源，即地下水和地表水，灌溉西红柿研究其表面微生物的多样性。454结果显示，与地表水相比，地下水中细菌的多样性更为丰富，采用这2种水资源对西红柿喷洒灌溉不会对西红柿表面细菌群落组成产生影响，即西红柿表面细菌群落组成无差异。目前，随着454测序技术的不断完善，以其强大的信息量作为优势，与日常生活息息相关的各类食品开始被尝试采用此技术对其所含微生物进行检测。Maiuta等［24］运用454测序技术研究化妆品制剂碳酸钙中微生物多样性。结果表明，化妆品制剂碳酸钙中不存在金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、大肠埃希菌(Escherichia coli)。此研究不仅可以用于确定化妆品制剂碳酸钙中微生物的多样性，还明确了化妆品或原材料中指示微生物的存在。这一研究确保一些潜在的重要微生物在危险评估中不被遗漏，为以后化妆品制剂碳酸钙中微生物的进一步研究奠定了基础。

2.5 454测序技术在其他方面的应用

近几年，454测序技术开始被运用于极端环境微生物的研究，Hollister［25］采用该方法研究La Sal del Rey盐湖底部沉积物中微生物群落结构。与克隆方法相比，454测序发现了许多新的类群。结合这2种方法，使得实验结果更具可靠性。此研究不仅证实了微生物群落结构与所在湖泊位置、磷、有机碳浓聚物及pH值有密切关系，而且显示了运用高通量测序技术研究复杂生态系统的价值。除此之外，Edwards［26］对美国明尼苏达州Soudan矿井中2个位点的水和沉积物的宏基因组进行分析，此2个位点地理位置邻近而化学和水文地质差异显著。454测序结果显示，2个位点的微生物代谢能力差异显著，大多数微生物的新陈代谢能力与所在环境的地化条件有关，该矿井中的微生物群落与其他环境中的微生物群落是完全不同的。

科学家们相信，极端微生物是这个星球留给人类独特的生物资源和极其珍贵的研究材料。开展极端微生物的研究，对于揭示生物圈起源的奥秘，阐明生物多样性形成的机制，认识生命的极限及其与环境的相互作用的规律等，都具有极为重要的科学意义。454测序技术为极端环境微生物的研究也带来了极大的便利，使得那些极端环境中的稀有微生物得以被描述，为了解生命极限和微生物适应机制，以及嗜极微生物资源的开发奠定了基础。

3 结语与展望

到目前为止，大量的研究者应用454测序技术对多种环境样品的微生物多样性进行了深入研究，这些研究大大增长了人类对微生物的存在和种类的认识。针对不同的研究对象，454测序技术不仅为研究提供了大量数据，证实研究对象所含微生物具有较高的多样性，而且还建立了一种研究复杂生态系统里的微生物多样性方法。云南大学云南省微生物研究所始终致力于极端环境微生物资源的挖掘。目前，结合传统克隆文库法和454测序技术深入系统地研究云南多种高盐环境中微生物的多样性，发现454测序技术获得了大量克隆方法无法检测到的新的细菌类群和古菌类群，而所需的时间缩短到原来的1/3，获得的数据量是同等经费下采用克隆方法所得数据量的近50倍，建立了应用454测序技术研究极端高盐环境的方法体系。

截止到2011年9月，罗氏公布了1 400多篇利用Genome Sequencer系统的、经同行评议发表的高水平论文［27］。这些文章中许多发表于Nature、Science、Cell、Genome Research、PNAS等高水平杂志上。研究人员正利用454测序的高准确率和超长序列读长来迅速获得高质量DNA序列。这些研究跨越了测序应用的多个方面，包括比较基因组学的从头测序和重测序;小分子RNA研究;宏基因组测序;转录组图谱分析(包括全转录组拼接和表达图谱);染色体结构和表观遗传学;有关稀有变异检测的超深度测序;研究古老DNA;微生物大规模鉴定、分型和突变的研究等。

多种多样的应用彰显出454测序系统应对重要研究领域的能力。但由于该技术刚刚起步因此也存在一些有待改善的问题，如在测定一连串相同核苷酸时容易产生错误;由于其依赖于包含一系列酶的焦磷酸检测，与其他第2代测序技术相比，其试剂价格相对较高。同时，序列读长较短也是限制该技术应用的原因之一。

虽然存在许多不足，454测序技术仍以其强大的测序能力渗透到生命科学研究的方方面面，包括那些此前无法用测序来解决的领域。在微生物生态学领域，凭借着454测序技术各方面的优势，终究将成为未来研究环境基因组的主导测序技术，同时，随着454技术的不断完善，该技术将为微生物生态学研究注入新的动力，成为微生物生态学研究新的亮点，大大加速微生物生态学的发展，增长人类对微生物生态学的认识，为人类探索广袤的微生物资源提供无限遐想。

［1］ Oliver JD.The viable but nonculturable state in bacteria［J］.Journal of Microbiology，2005，(43)：93-100.

［2］ Sanger F，Nicklen S，Coulson AR.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors［J］.Proceedings of the National A-cademy of Sciences of the United State of America，1977，74(12)：5463-5467.

［3］ Shendure J，Ji H.Next-generation DNA sequencing［J］.Nature Biotechnology，2008，26(10)：1135-1145.

［4］ http：//camera.calit2.net/.

［5］ http：//www.mothur.org/.

［6］ http：//bmf2.colorado.edu/fastunifrac/index.Psp

［7］ Roesch LF，Fulthorpe RR，Riva A，et al.Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity［J］.The ISME Journal，2007，1(4)：283-290.

［8］ Campbell BJ，Polson SW，Hanson TE，et al.The effect of nutrient deposition on bacterialcommunities in Arctic tundra soil［J］.Environmental Microbiology，2010，12(7)：1842-1854.

［9］ Lim YM，Kim BK，Kim C，et al.Assessment of soil fungal communities using pyrosequencing［J］.Journal of Microbiology，2010，48(3)：284-289.

［10］ He ZL，Xu MY，Deng Y，et al.Metagenomic analysis reveals a marked divergence in the structure of belowground microbial communities at elevated CO2［J］.Ecology Letters，2010，13(5)：564-575.

［11］ Leininger S，Urich T，Schloter M，et al.Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils［J］.Nature，2006，442(7104)：806-809.

［12］ Sogin ML，Morrison HG，Huber JA，et al.Microbial diversity in the deep sea and the underexplored“rare biosphere”［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America，2008，103(32)：12115-12120.

［13］ Huber JA，Mark Welch DB，Morrison HG，et al.Microbial population structures in the deep marine biosphere［J］.Science，2007，318(5847)：97-100.

［14］ Gaidos E，Rusch A，Ilardo M.Ribosomal tag pyrosequencing of DNA and RNA from benthic coral reef microbiota：community spatial structure，rare members and nitrogen-cycling guilds［J］.Environmental Microbiology，2011，13(5)：1138-1152.

［15］ Dinsdale EA，Pantos O，Smriga S，et al.Microbial ecology of four coral atolls in the northern line islands［J］.PLoS ONE，2008，3(2)：e1584.

［16］ Dos Santos HF，Cury JC，Do Carmo FL，et al.Mangrove bacterial diversity and the impact of oil contamination revealed by pyrosequencing：bacterial proxies for oil pollution［J］.PLoS ONE，2011，6(3)：e16943.

［17］ Angly FE，Felts B，Breitbart M，et al.The marine viromes of four oceanic regions［J］.PLOS BIOLOGY，2006，4：e3681.

［18］ Jaenicke S，Ander C，Bekel T，et al.Comparative and joint analysis of two metagenomic datasets from a biogas fermenter obtained by 454-Pyrosequencing［J］.PLoS ONE，2011，6(1)：e14519.

［19］ Sanapareddy N，Hamp TJ，Gonzalez LC，et al.Molecular diversity of a North Carolina wastewater treatment plant as revealed by pyrosequencing［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(6)：1688-1696.

［20］ Kwon，Soondong，Kim TS，et al.Bacterial community composition and diversity of a Full-Scale Integrated Fixed-Film Activated Sludge System as investigated by Pyrosequencing［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，20(12)：1717-1723.

［21］ Li XR，Ma EB，Yan LZ，et al.Bacterial and fungal diversity in the traditional Chinese liquor fermentation process［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，146(1)：31-37.

［22］ Lopez-Velasco G，Welbaum GE，Boyer RR，et al.Changes in spinach phylloepiphytic bacteria communities following minimal processing and refrigerated storage described using pyrosequencing of 16S rRNA amplicons［J］.Journal of Applied Microbiology，2011，110(5)：1203-1204.

［23］Telias A，White JR，Pahl DM，et al.Bacterial community diversity and variation in spray water sources and the tomato fruit surface［J］.BMC Microbiology，2011，11：81.

［24］ Maiuta N，Schwarzentruber P.Molecular detection of bacteria in calcium carbonate powder used in cosmetic formulations［J］.International Journal of Cosmetic Science，2011.Article first published online：8 MAR 2011 DOI：10.1111/j.1468-2494.2011.00648.x

［25］ Hollister EB，Engledow SA，Hammett AJM，et al.Shifts in microbial community structure along an ecological gradient of hypersaline soils and sediments［J］.The ISME Journal，2010，4：829-838.

［26］ Edwards RA，Rodriguez-Brito B，Wegley L，et al.Using pyrosequencing to shed light on deep mine microbial ecology［J］.BMC Genomics，2006，7：57.

［27］ http：//www.my454.com/.