冬虫夏草菌丝体水提物的抗新城疫病毒作用

刘彦威,王斌,刘娜,刘利强,林燕

(河北工程大学农学院,河北邯郸056021)

新城疫(Newcastle disease,ND),又称为亚洲鸡瘟,是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种高度接触性传染病,本病自1926年首次发生以来,已成危害养禽业发展的最严重的禽病之一。尽管对该病在诊断与防制方面进行了大量的研究,并取得了较大的成就,但目前尚无有效的治疗方法[1-2]。

冬虫夏草是一种名贵的中草药材,含有多种药理活性成份,比如核苷、多糖、甘露糖等。冬虫夏草具有多种生物活性：抗氧化、免疫调节、抗肿瘤,抗菌,调节血脂等[3-4]。目前,冬虫夏草的抗病毒活性报道较少。Ohta等[5]从北冬虫夏草中分离出一种酸性多糖,发现该多糖可以降低甲型流感病毒(influenzaAvirus)感染小鼠肺泡灌洗液中流感病毒滴度,升高血清中TNF-alpha和IFN-gamm等细胞因子的水平,具有较强的抗流感病毒的活性。最近,实验证明冬虫夏草提取物具有抗人巨细胞病毒活性和抗甲型流感病毒的活性[6]。鉴于此,本课题拟研究冬虫夏草是否具有抗鸡NDV活性。由于野生冬虫夏草的昂贵,本研究选用市面上可以买到的人工冬虫夏草菌丝体为研究对象,采用低温下水浸提的方法,获取冬虫夏草菌丝体粗提物,检测其抗鸡NDV活性。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

DMEM培养基(Gibco);MTT(Sigma);Vero细胞和新城疫病毒由中国农业大学传染病室惠赠。酶标仪(MB-IV)：北京艾普生物设备有限公司, CO2培养箱(BC-J80S)：上海搏迅实业有限公司医疗设备厂,倒置显微镜。

1.2 方法

1.2.1 冬虫夏草菌丝体水提物的配制

(1)在超净工作台中,取干燥菌丝体,放高速组织捣碎机,加入100mL水。温度控制在4℃,置摇床上浸提105rpm,每次浸提24h,8 000rpm离心留取上清,共浸提3次,每次均加入100mL水,合并上清后,250mL试剂瓶分装。

(2)放入-40℃冰箱,冷冻,真空冷冻干燥机冷冻干燥。得到浸膏后放-40℃冰箱保存,备用。

(3)取冻干菌丝体水提物,加入水,混匀,溶解后,用0.22μ m微孔滤膜过滤,放4℃冰箱备用,用细胞培养液(DMEM)稀释成使用液。

1.2.2 MTT检测

(1)待培养的Vero细胞铺满后,吸掉培养液上清,清洗两次,加入配制好的0.05%胰酶消化贴壁细胞,待细胞变圆脱落后,加入含10%FBS的培养液终止反应。

(2)将细胞吹匀后,计数,转入96孔板(104细胞/孔),其中第1列与第12列,加入不含细胞的培养液,放入CO2培养箱,37℃,5%CO2培养。

(3)24h后,观察细胞,如呈较好分布,则加入等量梯度稀释药物,其中第11列不加药物,作为对照。

(4)72h后,每孔分别加入含5mg/ml MTT的培养液30μ l,孵育6h。

(5)吸干上清后,加入DMSO 150μ l,在振荡器上混匀5min。

(6)用酶标仪读板,记录OD570nm值。

1.2.3 病毒液TCID50(半数感染量)的测定

吸取已培养好Vero细胞的96孔培养板(Costar)的培养液,将新城疫病毒(F48株)用维持液分别配成原液的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10悬液10管,接种在Vero细胞板中1h,吸弃病毒悬液,加维持液,每浓度梯度重复6孔,设空白对照和细胞对照。放于37℃、5% CO2培养箱中培养,72h后观察结果。CPE法判断细胞病变程度见表1。按Reed-Muench公式计算TCID50。新城疫病毒的TCID50为10-5。

表1 细胞病变程度判定标准Tab.1 Standards for determining of cytopathic effect

1.2.4 水提物对新城疫病毒的直接作用

将TCID50(10-5)、10TCID50(10-4)、100TCID50(10-3)的新城疫病毒悬液分别与水提物混合,37℃水浴1h,加入培养Vero细胞的96孔细胞板中作用1h,吸弃液体,加维持液,每组重复6孔,并设无毒浓度药品对照(仅加水提物)、细胞对照(病毒和水提物均不加)、病毒对照(仅接种病毒)。放于37℃,5% CO2培养箱中培养,72h用CPE法观察结果。

1.2.5 水提物对新城疫病毒的预防作用

将培养好Vero细胞的96孔板中的液体吸出,加入水提物 100μ L37℃作用1h,吸弃液体,加TCID50、10TCID50、100TCID50的新城疫病毒悬液100μ L 37℃作用1h,吸弃液体,并设无毒浓度药品对照、细胞对照、病毒对照。放于37℃,5%CO2培养箱中作用48h,用CPE法观察结果。

1.2.6 水提物对新城疫病毒的治疗作用

将培养Vero细胞的96孔板中的液体吸出,加TCID50、10TCID50、100TCID50的新城疫病毒悬液100μ L37℃作用1h,吸弃液体,加入水提物100μ L 37℃作用1h,吸弃液体,并设无毒浓度药品对照、细胞对照、病毒对照。放于37℃,5%CO2培养箱中作用48h,用CPE法观察结果。所得结果进行秩和检验中的Ridit检验。

2 结果

2.1 浸膏的特征

菌丝体经过粉碎、浸提、真空冷冻干燥后,形成浸膏,为褐色,较粘稠,但用水很容易将其融解,得到褐色的储备液(100mg/mL),最后用培养液稀释。

2.2 水提物的浓度与毒性

在选择冬虫夏草水提物的测试浓度时,当冬虫夏草水提物浓度为1mg/mL时,对细胞具有代谢毒性,而为0.1mg/mL时,无代谢毒性。所以我们选择2mg/mL,进行4倍系列稀释,这样可以保证有产生细胞毒性的浓度,也可保证较小的组间差别,而且梯度差别较大,OD值上可以表现出一定的差距。

当冬虫夏草水提物浓度为2mg/mL时,在镜下观察细胞形态,细胞边界清晰,但是有些细胞已经悬浮,细胞形态严重改变,胞质中有异物感,细胞发生严重的细胞病变。而在0.5mg/mL的浓度下。与未添加药物的细胞相比,镜下观察,没有变化。同时采用 MTT法,当冬虫夏草水提物浓度≤0.5mg/ml,发现细胞的活性基本没有变化(表2)。

表2 菌丝体水提物的细胞毒性试验Tab.2 Cytotoxicity assay of water extract from mycelium of Cordyceps sinensis

2.3 对病毒的作用

(1)直接杀灭作用。水提物在100TCID50病毒(10-3)时,对病毒抑杀作用不明显(表3),在10TCID50病毒(病毒量为10-4)时,明显抑制Vero细胞CPE形成,与病毒对照组统计学有显著性差异(P＜0.05),在1TCID50病毒(毒量为10-5)时,基本可抑制Vero细胞CPE形成。病毒对照有明显的细胞病变出现,而药物对照未见细胞病变,提示药物对细胞没有毒性作用。细胞对照也未出现病变。

表3 水提物抗病毒的直接杀灭作用Tab.3 Direct antivirus effect of Bran lectin on virus infection

(2)预防作用。水提物在 100TCID50病毒(10-3)和10TCID50病毒(10-4)时,对病毒抑杀作用不明显(表4),在1TCID50病毒(10-5)时,明显抑制Vero细胞CPE形成,与病毒对照组统计学有显著性差异(P＜0.05)。病毒对照有明显的细胞病变出现,而药物对照未见细胞病变,提示药物对细胞没有毒性作用。细胞对照也未出现病变。

表4 水提物对病毒的预防作用Tab.4 Preventive effect of Bran lectin on virus infection

(3)治疗作用。水提物对不同浓度的病毒均没有治疗作用(表5)。病毒对照有明显的细胞病变出现,而药物对照未见细胞病变,提示药物对细胞没有毒性作用。细胞对照也未出现病变。

表5 水提物对病毒的治疗作用Tab.5 Therapeutic effect of Bran lectin on virus infection

3 结论

1)大体积溶剂低温浸提,可以充分溶解成份,从而减小了低温下某些成份溶解速度慢,溶解度低的弊端。

2)0.5mg/ml冬虫夏草水提物对细胞的代谢无影响。

3)体外实验发现水提物对病毒具有预防和抑杀作用,而对细胞没有毒性,是一种低毒的体外抗新城疫病毒物质,具有潜在的抗鸡新城疫病毒临床应用价值。

[1]DOUGLAS KO,LAVOIEMC,KIM LM,et al.Isolation and genetic characterization of avian influenza viruses and a Newcastle disease virus from wild birds in Barbados：2003-2004 [J].Avian Dis,2008,51(3)：781-787.

[2]QIN Z M,TAN L T,XU H Y,et al.Pathotypical characterization andmolecular epidemiology of Newcastle disease virus isolates fromdifferent hosts in China from1996 to 2005[J].J Clin Microbiol,2009,46(2)：601-11

[3]CHIH F K,CHENG C C,CHIOU F L,et al.Abrogation of streptococcal pyrogenic exotoxin B-mediated suppression of phagocytosis in U937 cells by Cordyceps sinensis mycelium via production of cytokines[J].Food and ChemicalToxicology.2007(45)：278-285.

[4]CHIH F K,CHENG C C,Yueh H L,et al.Cordyceps sinensis mycelium protects mice from group A streptococcal infection[J].Journal of Medical Microbiology,2005(54)：795-802.

[5]OHTA Y,LEE J B,HAYASHI K,et al.In vivo anti-influenza virus activity of an immunomodulatory acidic polysaccharide isolated from Cordycepsmilitaris grown on germinated soybeans[J].J Agric Food,2007,55(25)：10194-10199.

[6]秦雪.冬虫夏草水提物抗人巨细胞病毒研究[D].南宁：广西医科大学,2009.