石藤胶囊对佐剂性关节炎大鼠关节病变的影响 *

王振亮,姚乃礼

(1.河南中医学院仲景医药研究所,河南郑州 450008;2.中国中医科学院广安门医院,北京 100053)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以对称性、多关节、小关节病变为主的慢性、全身性、进行性、自身免疫性疾病,因可引起多系统、多器官的病变,又称为类风湿病[1]。其发病机制迄今未明,也无特异性的治疗药物。笔者以补益肝肾、化痰活血通络为治法研制了石藤胶囊,并就其对大鼠佐剂性关节炎(ad juvantarthritis,AA)关节病变的影响进行了观察,总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 动 物

清洁级健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,2月龄,体质量 150～180 g,由河北省实验动物中心提供,动物质量合格证号:0804102。

1.2 药品与试剂

石藤胶囊为院内制剂,0.5 g/粒,由河南省安阳151医院制剂室提供,制剂批号为 070510;雷公藤多苷片,10mg/片,黄石飞云制药有限公司产品,批号为 061101。注射用卡介苗,60 mg/支,由上海生物制品研究所提供,批号为 20080215。羊毛脂,由天津市光复精细化工研究所提供,批号为 20070923;关节组织核因子κB受体激活配体(receptoractivator of NF-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)大鼠ELISA试剂盒,上海西唐生物科技有限公司提供;OPG羊抗鼠和RANKL羊抗鼠,美国Santa Cruz公司产品;SP试剂盒和DAB显色试剂盒,由北京中山公司提供。

1.3 模型的建立

动物实验性喂养 2周后,参照文献[2]方法,以卡介苗与不完全弗氏佐剂充分乳化混匀配成10 g/L的乳剂,于每鼠右后足跖皮内注射0.05 mL致炎。

1.4 分组与给药

造模后第 19天,随机选取出现多发性关节炎症状的大鼠 40只,并随机分为模型对照组,石藤胶囊大、中、小剂量组,雷公藤组,每组 8只。将注射生理盐水大鼠作为正常对照组。分别测双侧后足爪容积后,各组按每日10μL/g连续灌胃给药或给等体积生理盐水,持续 21 d。石藤胶囊小、中、大剂量组每日依次灌服石藤胶囊450,600,750μg/g;雷公藤组每日灌服雷公藤多苷片 6μ/g;模型对照组和正常对照组灌服等体积的生理盐水。于给药结束后第 2天再次测量各组大鼠足爪容积,经腹主动脉采血, 3 500 r/min离心10min,取血清,-70℃冰箱保存待测。

1.5 检测指标

1.5.1 足爪肿胀抑制率

用适当浓度苦味酸溶液(2,4,6-三硝基苯酚)于大鼠踝关节处做一标记。测量时,将大鼠后肢浸入容积杯中使踝关节标记与液面重叠,抽吸上升液体至原液面水平,计算液体量,即为实测足爪容量。

肿胀率(%)=(致炎后足爪容积-致炎前足爪容积)/致炎前足爪容积×100%。

1.5.2 关节炎指数积分

采用关节炎指数积分法[3]。根据未注射完全佐剂的其余 3个肢体的关节红肿程度、范围及关节肿大变形情况,累计得出关节炎指数。0分:无关节炎。1分:关节表面有红色斑点或关节部位轻度肿胀。2分:关节部中度肿胀。3分:关节部位严重肿胀。4分:关节部位严重肿胀,且不能负重。

1.5.3 大鼠关节病理积分

大鼠取血后立即取踝关节,用 4%多聚甲醛溶液固定,10%EDTA溶液脱钙20 d,常规石蜡包埋切片,行苏木精-伊红(HE)染色,常规光镜观察滑膜增生、炎性细胞浸润、软骨骨质破坏及关节周围组织水肿等组织形态变化,并根据文献[4]方法进行半定量评分。标准如下:关节具有正常的结构(如关节间隙、软骨、骨和滑膜组织等),计0分;关节组织中有纤毛形成和轻度的关节炎症,并有滑膜增生,血管数量增加,以及小的炎性细胞灶,无软骨和骨的侵蚀破坏,计 1分;关节有软骨的侵蚀破坏,有中度的关节炎症,有大量炎细胞浸润,滑膜增生和血管翳形成较严重,无骨破坏,关节结构无破坏,计 2分;有严重的血管翳形成,广泛的软骨侵蚀破坏,可见骨破坏,关节结构破坏,计 3分。

1.5.4 大鼠关节中RANKL、OPG的表达

行免疫组化检验的切片二甲苯脱蜡,梯度酒精去除二甲苯后,以磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,每次3min,0.3%过氧化氢-甲醇溶液37℃温育45 min。纯化水冲洗,PBS浸泡5m in,微波抗原修复30min。PBS洗3次,每次3 min,滴加羊抗鼠RANKL (1∶200)或羊抗鼠OPG(1∶200),4℃孵育过夜。阴性对照用PBS代替一抗。PBS洗3次,每次3 min,滴加生物素化的兔抗羊二抗,37℃温育30 min。PBS洗3次,每次3 min,滴加链霉素-辣根过氧化物酶标记的三抗,37℃温育30 min。PBS洗3次,每次3 min,DAB显色,脱水、透明中性树胶封片。

RANKL、OPG表达的计数方法:RANKL阳性细胞为细胞膜或胞浆呈橘黄色或棕黄色,RANKL蛋白主要表达于滑膜、局部骨侵蚀处。每张切片在 400倍镜下随机挑选 10个视野,每个视野查 100个细胞,分别计算每个视野中RANKL阳性细胞数占该区域中细胞总数的百分数,求其平均值。OPG阳性的细胞为细胞质着色,呈颗粒状的棕黄色或棕褐色。OPG主要由成骨细胞表达,也可见于滑膜细胞。每张切片在 400倍镜下随机挑选 10个视野,每个视野查100个细胞,分别计算每个视野中OPG阳性细胞数占该区域中细胞总数的百分数,求其平均值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数(BZ_139_2138_999_2156_1045)±标准差(s)表示,各组间均数比较采用单因素方差分析。方差分析前进行齐性检验,采用LSD进行统计。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 石藤胶囊对佐剂性关节炎大鼠足爪肿胀抑制率的影响

大鼠右后足接种完全弗氏佐剂后约9 d,前肢及左后足出现关节炎症状,约24 d后红、肿等炎症表现达到高峰。见表 1。

表1 各组大鼠足爪肿胀抑制率对比%,±s

表1 各组大鼠足爪肿胀抑制率对比%,±s

注:与模型对照组对比,**P＜0.01;与石藤胶囊大剂量组对比,#P＜0.05。

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2.2 石藤胶囊对佐剂性关节炎大鼠关节炎指数的影响

见表2。

表2 给药前后各组大鼠关节炎指数对比 分,±s

表2 给药前后各组大鼠关节炎指数对比 分,±s

注:与模型对照组对比,**P＜0.01;与石藤胶囊小剂量组对比,#P＜0.05。

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2.3 石藤胶囊对佐剂性关节炎大鼠关节病理积分的影响

见表3。

表3 各组大鼠踝关节病理积分对比 分,±s

表3 各组大鼠踝关节病理积分对比 分,±s

注:与模型对照组对比,*P＜0.05;与石藤胶囊大剂量组对比, #P＜0.05。

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2.4 石藤胶囊对佐剂性关节炎大鼠关节中RANKL、OPG表达的影响

见表4。

表4 各组大鼠关节中RANKL、OPG表达对比%,±s

表4 各组大鼠关节中RANKL、OPG表达对比%,±s

注:与正常对照组对比,**P＜0.01;与模型组对比,#P＜0.01;与石藤胶囊大剂量组对比,△P＜0.05;与雷公藤组对比,＊P＜0.05。

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3 讨 论

中医学无 RA病名,对其认识散见于“痹证”、“历节”、“痛风”等病证中。本病多以肝肾亏虚为发病之本,外感之邪为发病诱因。因病程长久,久病多瘀、久病入络,以致痰凝血瘀,痹阻络脉,流注筋骨、关节、肌肉、血脉而为病。用补益肝肾法治疗 RA可谓“正其本”。痰瘀痹阻的存在使 RA久羁难愈,而久治不愈又加重了痰瘀的痹阻,两者形成恶性循环,故用化痰活血法治疗RA可谓“畅其流”。依此笔者以补益肝肾、化痰活血通络为法研制了石藤胶囊。方中石楠藤祛风,通络益肾,治风痹、腰背酸痛[5];雷公藤祛风通络,消肿止痛,可助石楠藤以通络止痛;怀牛膝补肝肾,强筋骨,活血通经,“治腰膝骨痛,足痿筋挛”(《本草备要》);三七有散瘀止血,消肿定痛功能[6],又可助石楠藤活血之不逮,益其止痛之功能;莱菔子 “化痰除风,散邪发汗”(《本草再新》),长于利气,既可化痰通利关节,也能防滋补碍胃之弊,与三七配伍,能化痰活血以除痰瘀之痹阻,通行经络而止不通之疼痛。全方共奏补益肝肾、化痰活血通络之效。

本实验结果显示,石藤胶囊可明显降低 AA大鼠的足爪肿胀度,提高对关节肿胀的抑制率,在减轻滑膜的病理改变(滑膜水肿、增生和炎细胞浸润,软骨的破坏)方面,疗效明显优于雷公藤多苷,且随着用药量的增加,效果越明显。RA关节的破坏包括滑膜、软骨、软骨下骨的侵蚀,虽然对造成这些关节破坏的机制尚未完全阐明,但破骨细胞(osteoclast, OC)在其中的作用已被大量的实验所证实[7]。它所介导的骨破坏是通过细胞间相互作用和多种细胞因子调控实现的,其中RANKL/OPG系统处于中心地位,RANKL可以直接激活OC细胞膜上的NF-κB受体活化因子(receptor activator of NF-κB, RANK)。OPG又称破骨细胞抑制因子,主要抑制OC的分化、活化成熟以及细胞数量,是RANKL的天然阻滞受体,可阻断其与RANK的结合[8]。有学者[9]发现,在RA患者骨关节中RANKL的表达相对OPG局限,大多分布于破骨细胞介导的骨质破坏处,即关节面血管翳与骨的交界处。OPG可在滑膜组织多数细胞中表达,但具有倾向分布于有RANKL表达的骨质破坏处的特点,这也进一步说明了 OPG阻滞RANKL对骨破坏的作用。目前认为RANKL是前体破骨细胞分化、成熟的启动因子[10]。临床观察也发现[11],RA患者血清、滑液中OPG水平降低, RANKL、RANK水平升高。本实验观察到,AA大鼠的滑膜、软骨下骨、骨小梁局灶侵蚀处可见RANKL表达增高,在软骨下骨、骨小梁区域有OPG的高表达,这和文献报道[12-13]一致。实验结果还表明,关节中OPG的表达水平模型对照组明显低于正常对照组,RANKL的表达水平模型对照组明显高于正常对照组,证明AA的关节骨质破坏是由破骨细胞通道激活所引起的。石藤胶囊各剂量组的OPG表达明显高于模型对照组,RANKL表达明显低于模型对照组,石藤胶囊中、小剂量组与模型对照组对比,差别也有统计学意义(P＜0.05),但疗效不及大剂量组。表明石藤胶囊在保护 AA骨破坏方面有良好效果,同时有一定的量效关系。石藤胶囊通过抑制破骨细胞通道防治骨破坏可能是其治疗RA的作用机制之一。

雷公藤多苷是我国自行开发的抗风湿药,对RA有较好疗效。本实验表明石藤胶囊改善关节肿胀的效果好于雷公藤多苷(P＜0.01),改善RANKL、OPG指标方面与雷公藤多苷相当(P＞0.05),说明石藤胶囊对 AA有明显效果,值得进一步研究。

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