热补针法对关节炎兔的镇痛后效应及其脑脊液中 β-EP和CCK-8含量的影响*

杜小正,方晓丽,东贵荣

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院针灸科,上海 200437;2.甘肃中医学院针灸推拿系,甘肃兰州 730000)

笔者前期的实验研究结果证明,热补针法即时镇痛效应与捻转针法相同,而后效应优于捻转针法,并证明与外周炎症局部镇痛物质的变化也有关[1-2],推测两种针法不同的镇痛后效应与中枢镇痛物质的变化也有关。笔者以卵蛋白诱导的关节炎兔为疼痛模型,探求热补针法的针刺镇痛后效应及中枢作用机制,以期为临床治疗痛证提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康2～3月龄青紫蓝兔 70只,体质量(2.5± 0.5)kg,雌雄各半,由卫生部兰州生物制品研究所实验动物中心提供,动物质量合格证号:医动字第甘肃省14-021号。

1.2 主要仪器与试剂

SN-695B型智能放免γ测量仪,上海日环产品;FA2004N型电子分析天平,上海精密科学仪器有限公司产品;TG-16G型台式离心机,上海安亭产品;WQ-9E测痛仪,北京海淀区电子仪器厂产品;卵蛋白干粉及完全弗氏佐剂,上海升正产品,批号为200712;β-EP、CCK-8放免试剂盒,第二军医大学神经生物教研室产品。

1.3 动物分组

将已驯养1周并测痛阈在1.8mA左右、能引起缩腿反应的 60只青紫蓝兔用于实验。痛阈测定小于1.30mA或大于2.30 mA者为动物反应过敏或迟钝,弃之不用。将 60只兔按体质量随机分为正常组(n=6)、模型组(n=6)、捻转组(n=24)和热补组(n=24),后2组又随机分为针后即时(0 h)和针后0.5,1,2 h亚组,每亚组各6只。

1.4 动物模型的建立

模型组以及捻转组、热补组各亚组均采用卵蛋白诱导法建立关节炎疼痛模型[3]。方法:于造模前3 d用脱毛剂脱去家兔双侧后腿膝关节周围和背部肩胛骨间的毛。将4 g/L的卵蛋白溶液与等量完全弗氏佐剂混匀,充分震荡成乳化剂。在兔肩背部均匀选6个点,每点皮下注射该溶液0.2 mL。14 d后以相同剂量重复皮下注射 1次。第 2次免疫后 6 d,在兔双膝关节内分别注入 20 g/L卵蛋白生理盐水溶液0.4mL。在24 h之内关节出现红肿,表示造模成功。

1.5 针刺治疗

在兔双膝关节内注入卵蛋白生理盐水溶液后第7天针刺治疗双侧后腿足三里和双侧前腿的合谷穴(取穴参照林文注《实验针灸学》家兔常用针灸穴位定位标准并以对比解剖学为依据定位)1次。方法:将针直刺入穴内 0.8～1.2 cm,捻转组施以前后捻转的手法,指力均匀,角度适当(180～360度),双向捻转,每穴操作1min,留针30 min;热补组用热补针法,右手拇指向前连续捻按针柄 3～5次,待针下沉紧,针尖拉着有感应的部位,连续重插轻提 3～5次,拇指再向前连续捻按针柄 3～5次,针尖顶着产生感觉的部位守气1min,留针30min。正常组和模型组青紫蓝兔以同样的方式固定30min,不做其他处理。

1.6 检测指标

痛阈:各治疗组在治疗后即时、0.5 h、1 h和2 h测痛阈。检测方法参照文献[4]。在右膝关节表面安装含有饱和KCL溶液的电极,无关电极接右前肢,两极与WQ-9E测痛仪相连,用电流强度线型递增的直流电将 K+导入皮肤,做疼痛刺激。以右后腿的收缩性反应作为疼痛指标,以引起家兔腿收缩的最小电流强度作为痛阈。共测 3次,每次之间间隔5 min,取其平均值作为痛阈。

β-EP、CCK-8:测完痛阈后将家兔以30%乌拉坦按1 g/kg经耳缘静脉注射麻醉,取侧卧位用7号静脉穿刺针经枕外隆凸下 0.5 cm处进入小脑延髓池,抽取脑脊液 1m L,注入提前浸在冰浴中的收集管中,立即在沸生理水中煮5 min,4℃,4 000 r/min离心 20 min,取上清液,-20℃低温保存待测。采用放射免疫技术测定β-EP和CCK-8的含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数(BZ_139_2138_999_2156_1045)±标准差(s)表示,各组间均数对比用单因素方差分析(ANOVA),组间均数的两两对比,方差齐时选择LSD法,方差不齐时选择Dunnett T3法。以 P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 热补针法对家兔关节局部痛阈值的影响

模型组痛阈显著低于正常组(P＜0.01);与0 h模型组对比,捻转组和热补组针后各时刻痛阈均显著升高(P＜0.01或P＜0.05),但均低于0 h正常组(P＜0.01);热补组即时痛阈与捻转组即时痛阈对比,差别无统计学意义 (P＞0.05);热补组其他时间点痛阈均显著高于捻转组(P＜0.05或P＜0.01)。见表 1。

表1 各时间点各组家兔关节局部痛阈值对比 mA,±s

表1 各时间点各组家兔关节局部痛阈值对比 mA,±s

注:与0 h正常组对比,**P＜0.01;与0 h模型组对比,#P＜0.05,##P＜0.01;与捻转组相同时间点对比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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2.2 热补针法对家兔脑脊液中β-EP含量的影响

模型组脑脊液中β-EP含量高于正常组(P＜0.01);与 0 h模型组对比,捻针组和热补组各时刻β-EP含量均显著性升高(P＜0.01);热补组即时β-EP含量与捻转组即时 β-EP含量对比差别无统计学意义(P＞0.05);其他时刻β-EP含量,热补组均明显高于捻转组(P＜0.05或P＜0.01)。见表2。

表2 各时间点各组家兔脑脊液中β-EP含量对比 mg·L-1,±s

表2 各时间点各组家兔脑脊液中β-EP含量对比 mg·L-1,±s

注:与0 h正常组对比,**P＜0.01;与0 h模型组对比,#P＜0.05,##P＜0.01;与捻转组相同时间点对比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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2.3 热补针法对家兔脑脊液中CCK-8含量的影响

模型组脑脊液中CCK-8含量显著低于正常组(P＜0.01);与0 h模型组对比,捻针组和热补组各时刻CCK-8含量有显著回升(P＜0.01或P＜ 0.05),但均显著低于正常组(P＜0.01);热补组即时、0.5 h CCK-8含量与模型组对比差别无统计学意义(P＞0.05),而热补组1 h、2 h CCK-8含量显著高于捻转组(P＜0.05,P＜0.01)。见表3。

表3 各时间点各组家兔脑脊液中CCK-8含量对比 mg·L-1,±s

表3 各时间点各组家兔脑脊液中CCK-8含量对比 mg·L-1,±s

注:与0 h正常组对比,**P＜0.01;与0 h模型组对比,#P＜0.05,##P＜0.01;与捻转组相同时间点对比,△P＜0.05,△△P＜0.01。

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3 讨 论

痛阈是目前被广泛采用以判断镇痛效果的指标。本研究结果显示,经针刺治疗后,捻转组和热补组各时刻关节局部痛阈均显著高于模型组,提示捻转针法和热补针法的镇痛效应均至少持续 2 h以上,这与某些报道[5]不一致。热补针法的即时镇痛效应与捻转针法对比差别无统计学意义(P＞0.05),但热补组针后0.5 h、1 h、2 h的痛阈显著高于捻转组(P＜0.01或P＜0.05),说明热补针法的镇痛后效应优于捻转针法。

针刺镇痛的原理是多方面的,无论用手捻针或电针,其中激活中枢内源性阿片肽(EOP)的释放起着关键性的作用[6-7]。β-EP为内啡肽家族成员之一,研究证明针刺通过促进中枢和外周 β-EP的释放参与了针刺镇痛过程[2,8]。本实验证实,经过治疗后两治疗组即时痛阈在升高的同时,脑脊液中β-EP含量均有上升,而且热补组0.5 h、1 h、2 hβ-EP含量显著高于捻转组,与痛阈的变化呈正相关,提示脑脊液中β-EP不但参与针刺镇痛,而且与热补针法和捻转针法镇痛后效应有差异相关联。

针刺引起阿片肽释放的同时也引起中枢抗阿片肽的释放,中枢神经系统中阿片和抗阿片的相互作用是决定针刺镇痛效果优劣的决定性因素之一[9]。CCK-8是目前已知的作用最强的内源性抗阿片肽,是中枢抗阿片镇痛的物质之一。研究[10-11]表明:加强脑内CCK基因表达,可以降低针刺镇痛效果;抑制其基因表达,则可提高针刺效应。在本实验条件下,经过治疗后两治疗组即时 CCK-8含量均有回升,热补组1 h、2 h CCK-8含量显著高于捻转组,与痛阈和 β-EP的变化趋势相同,说明针刺可促使CCK-8在中枢的释放向正常水平恢复,而且CSF中CCK-8与形成热补针法和捻转针法不同镇痛后效应有关。

总之,本实验结果表明,热补针法有非常显著的镇痛后效应,热补针法镇痛后效应优于捻转针法,脑脊液中β-EP和CCK-8含量变化与两种针法镇痛后效应不同有明显相关趋势。

[1]杜小正,秦晓光,赵彬元,等.传统“热补”针法对实验性关节炎兔的镇痛效应及脑脊液中β-EP、CCK-8含量的影响[J].针刺研究,2006,31(2):86-89.

[2]杜小正,秦晓光,方晓丽.热补针法镇痛后效应及其对关节局部组织β-内啡肽和前列腺素 E2的影响[J].针刺研究,2009,34(5):319-323.

[3]Tominaga K,Alstergren P,Kurita H,et al.Clinical course of an antigen-induced arthritis model in the rabbit temporomandibular joint[J].Oral Pathol Med,1999,28:268-273.

[4]蓝敏,沈庆旗,王巧云.半导体激光对兔骨折后痛阈的影响[J].江苏大学学报:医学版,2003,13(2):160-162.

[5]梁繁荣,罗荣,刘雨星,等.电针镇痛后效应与炎症局部5-HT、NE、DA含量关系的实验研究[J].中国中医基础医学杂志,2001,7(11):52-55.

[6]Mayer DJ,Price DD,Rafii A,et al.Antagonism of acupuncture anal-gesia in man by the narcotic antagonist naloxone[J]. Brain Res,1977,121(2):368.

[7]Cheng RS,Pomeranz B.E lectroacupunctureanalgesia could bemediated by at least two pain relieving mechanisms:endorphin and non-endorphin system[J].Life Sci,1979,25 (23):1957.

[8]陈谨,刘光谱,周春阳.下丘脑β-EP及POMC mRNA的表达在针刺镇痛后效应中的作用[J].针刺研究,2004, 29(1):5-9.

[9]韩济生.中枢阿片肽和胆囊收缩素功能活动的消长是决定针刺镇痛有效性的重要因素[J].北京医科大学学报, 1996,28(5):321.

[10]Tang NM,Dong HW,Wang XM,et al.Cholecystokinin antisense RNA increases the analgesic effect induced by electroacupuncture or low dosemorphine:conversion of low responder rats into high responders[J].Pain,1997,71 (1):71-80.

[11]Lee G,Rho S,Shin M,etal.The association of cholecystokinin-A receptor expression with the responsiveness of electroacupuncture analgesic effects in rat[J].Neurosci Lett,2002,25(1):17-20.