慢性脑缺血老龄大鼠海马区突触素及NMDAR2B表达的研究

郭 铁

南阳医学专科学校第一附属医院 南阳 473000

慢性脑缺血是指因动脉粥样硬化等因素造成的长期脑部慢性缺血,进而导致脑代谢障碍和功能衰退,其症状主要包括,眩晕、耳鸣、智力减退、记忆力下降或注意力不集中、定向力障碍等,患病率较高。突触素(synaptophysin)是一种位于突触囊泡膜上与突触功能密切相关的多糖膜结构蛋白,具有缝隙连接样通道性质并参与Ca2+依赖神经递质乙酰胆碱、谷氨酸的释放[1]。谷氨酸受体NMDAR有两个显著区别其他谷氨酸受体的特性,第一是具有电压依赖的Mg2+离子阻断作用,第二是NMDA受体不仅对单价离子Na+、K+有通透性,且对Ca2+也具有高通透性。NMDA受体在中枢神经系统发育过程中有重要作用,可调节神经元的存活、树突和轴突的结构发育、突触的可塑性及突触重排等,在神经回路的形成及学习记忆过程中,NM DA受体也有促进作用。NR2B是NMDAR中的主要功能亚单位[2]。本实验旨在观察慢性脑缺血老龄大鼠海马区突触素及NR2B表达的变化,以探寻治疗慢性脑供血不足的方法。

1 材料和方法

1.1 药品及试剂 小鼠抗突触素单克隆抗体,兔抗NR2B亲和纯化兔抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司;SP免疫组化试剂盒,DAB显色剂均购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2 动物分组 健康Wistar大鼠100只,随机分为5组,A组(假手术组)、B组(缺血4周组)、C组(缺血8周组)、D组(缺血12周组)、E组(缺血16周组),每组20只。

1.3 动物模型的制作 参照Ohta[3]等制作慢性脑缺血动物模型的方法,结扎双侧颈总动脉,对照组除不结扎双侧颈总动脉外,其他处理同动物模型制作。

1.4 免疫组化结果的分析 采用上海山富科学仪器有限公司提供的Biosens Digital Imaging System病理图文分析系统进行结果分析。每张切片在目标区域随机选取5个视野测定其灰度值,采集5组数据,取其平均值作为该切片目标区域的平均灰度值。每组切片依次完成检测,计算该组切片被检区域灰度值的平均值及标准差。

2 结果

2.1 突触素 CA1区以多形层和辐射层染色较深,腔隙分子层次之,锥体层和颗粒层细胞的轮廓有点状标记。CA3区苔藓纤维层可见较多颗粒,齿状回染色较浅。各组间突触素表达水平的比较显示,缺血第4、8、12周及16周组突触素灰度值分别低于对照组(P＜0.05);缺血第12周及第16周组还分别低于缺血第4、8周组,差异均有统计学意义(P＜0.05);其余各组间相比,差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠海马不同区域突触素灰度值比较 (±s)

表1 各组大鼠海马不同区域突触素灰度值比较 (±s)

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2.2 NR2B CA1区锥体细胞胞膜着色较强,放射层及腔隙分子层的顶树突染色强度和锥体细胞胞膜呈基本相同的较强染色。在CA3区,胞膜染色较强,胞质染色较淡,透明层及放射层的顶树突基本不着色,仅基部存在着色。齿状回颗粒细胞密集排列,呈现小空泡状。各组间NR2B表达水平的比较显示,缺血第4、8、12以及16周组NR2B灰度值分别低于对照组(P＜0.05);缺血第12周及第16周组还分别高于缺血第4、8周组,差异均有统计学意义(P＜0.05);其余各组间相比,差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 各组大鼠海马不同区域NR2B灰度值的比较 (±s)

表2 各组大鼠海马不同区域NR2B灰度值的比较 (±s)

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3 讨论

突触是神经系统中最基本的功能单位,其对大脑整体功能的维持有至关重要的作用。突触的发育和其功能的发挥都与突触素密切相关。突触素(synaptophysin)主要分布于含经典神经递质的小型突触小泡膜上[4]。突触小泡中含有高浓度的化学递质,当Ca2+与突触素结合后,能诱导小泡膜去极化,启动小泡膜与突触前膜连接形成孔道样结构,使神经递质由小泡释放至突触间隙,产生传递效应[5]。另外,突触素还与突触的形成密切相关[6]。突触的数量及其结构的完整性关系到大脑记忆学习等功能的正常发挥[7-8]。在本试验中慢性脑缺血模型大鼠海马突触素的表达在第4、8、12、16周逐渐减少,意味着其记忆学习等功能的减退,而出现慢性脑缺血的症状。

大脑学习和记忆功能并非单纯突触素的作用,另有研究发现敲除小鼠NR2B基因后,其记忆能力下降;而移植转染NR2B基因细胞可使大鼠记忆明显增高;学习过程也可以提高NR2B通道蛋白的磷酸化程度[2]。Clayton[9]的研究发现,老年大鼠较青年大鼠脑内NR2BmRNA和蛋白质均明显减少,而N R1、NR2A、AM PAR、GluR2的表达未见减少,提示老年大鼠的NR2B表达减少,长时程增强受损,学习记忆出现障碍。其表达减少,与学习记忆功能的减退呈相关性。在本试验中发现,慢性脑缺血模型大鼠海马NMDA受体亚单位NR2B的表达在第4、8、12、16周逐渐减少。

慢性脑缺血老龄大鼠海马中突触素及NR2B的表达,随时间延长逐渐减少,这些表达的变化,在慢性脑缺血症状的发展中,起到了重要的作用,进一步针对其作用机制进行研究,有利于对慢性脑缺血进行有效的治疗。

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