Lachnum YM 328多糖发酵条件优化及抗氧化性

陈吴西， 蔡敬民， 邱 涛， 张利兵， 叶 明

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥 230009;2.合肥学院生物与环境工程系，安徽合肥 230022)

0 引 言

真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的，能够控制细胞分裂分化、调节细胞生长衰老的一类活性多糖[1]。大量研究表明，多糖具有免疫增强与调节、抗病毒、抗放射、抗肿瘤、抗凝血、抗衰老以及抗氧化等作用[2-5]，是公认的安全低毒活性物质。

利用微生物生产多糖可以不受季节变化的影响，微生物多糖的收集与纯化相对其它多糖而言更容易[6]，微生物多糖越来越受到人们的关注。粒毛盘菌属Lachnum Retz是晶杯菌科(H ya-loscyphaceae)真菌，其分布广泛，通常腐生在各种植物基质上。近十几年来，我国学者在粒毛盘菌方面做过不少研究[7-10]，人们发现粒毛盘菌属中有的种能产生生物活性物质，说明粒毛盘菌具有重要的应用前景[11-13]。本文对一株粒毛盘菌YM 328发酵条件以及其胞外多糖抗氧化活性进行了研究，以期为盘菌多糖的开发和利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌株及培养基

粒毛盘菌(Lachnum)YM 328，合肥工业大学微生物资源与应用研究室分离保藏菌种。

发酵培养基:液体PDA培养基。

1.2 YM 328胞外多糖的发酵、提取和测定

摇瓶培养条件为温度25℃，转速180 r/min，装液量50 m L(容积为150 m L的三角瓶)，在此条件下培养10 d。

提取方法:将50m L发酵液过滤，滤液浓缩，加3倍体积的无水乙醇，4℃下醇沉。离心除去上清液，沉淀用蒸馏水溶解并定容至50 m L，加1m L 30%的H 2O2，50℃保温脱色，Sevage法脱蛋白[14]，得到胞外多糖溶液。

采用苯酚-硫酸法测定多糖质量浓度[15]，以葡萄糖为标准物，用721E型可见光光度计作比色分析。

1.3 YM 328胞外多糖发酵条件

1.3.1 碳、氮源对菌株YM 328多糖发酵的影响

分别用20 g/LCMC-Na、蔗糖、淀粉、麦芽糖代替基础发酵培养基中的葡萄糖配制不同碳源培养基各50 m L，装入150 m L的锥形瓶中，用打孔器接入直径为3mm的菌块，25℃、150 r/m in摇床培养10 d，测定多糖质量浓度。分别以5 g/L蛋白胨、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素、酵母膏为氮源[16]，并选择最适碳源配制发酵培养基，方法同上。

1.3.2 金属离子对YM 328多糖发酵的影响

选择最适碳氮源配制发酵培养基，分别添加0.01 g/L硫酸锰、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜和硫酸镁，以不加金属离子的发酵液为对照。调节pH值为最适，接种菌龄相同菌块装于50m L不同生长因子发酵培养基的 150 m L锥形瓶中，25℃、150 r/m in摇床培养 10 d，测定多糖质量浓度。

1.3.3 时间对YM 328多糖发酵的影响

选择最适碳氮源和最佳生长因子配制发酵培养基，并调节最适pH值，接入直径3 mm的菌块，25℃、150 r/m in摇床培养6、8、10、12、14 d，测定多糖质量浓度。

1.3.4 正交试验

在单因素试验基础上，以碳源、氮源、金属离子为3因素，各取4个水平，选择L16(45)正交表进行试验。

1.4 YM 328胞外多糖抗氧化活性测定

1.4.1 胞外多糖对◦OH的清除作用

按照Sm irnoff的方法(有改动)，利用H2 O2与Fe2+混合产生◦OH，在体系内加入水杨酸捕捉◦OH并产生有色物质，该物质在510 nm下有最大吸收。反应体系中含 8.8 mmo l/L H2O2、9mmol/L FeSO4、9mmol/L水杨酸/乙醇、不同质量浓度(10、20、30、40、50、60 mg/L)的多糖溶液各1 m L，最后加H2O2启动反应，37℃反应0.5 h，以蒸馏水为参比，在510 nm下测量不同质量浓度下的吸光度。考虑到多糖本身的吸光值、以9 mm ol/L FeSO4、9 mmol/L水杨酸/乙醇、不同质量浓度的多糖溶液和蒸馏水各1m L做为多糖的本底吸收值[17]。

清除率计算公式为:

其中，A0为空白对照液的吸光度;A x为加入多糖溶液后的吸光度;A x0为不加显色剂H2 O2多糖溶液本底的吸光度。

[18]的方法进行。取3m L不同质量浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)多糖溶液，2m L PBS溶液(pH值为 6.0)和 0.1 m L 200μg/m L NaNO2溶液于试管中，用水添加至10 m L后，将混合液置于37℃恒温1 h。然后与等容积的G riess试剂(1%对氨基苯磺酸、0.1% N-1-萘基乙二胺、2.5%H3PO4)混合，静置10 m in后，蒸馏水做参比，于538 nm处测其吸光度，同时测定对照样(不含亚硝酸钠，含有多糖)和空白样(不含多糖，蒸馏水代替多糖)吸光度。VC作为样品对照。亚硝酸钠的清除活性公式为:

其中，S a为亚硝酸钠的清除率;ODs为空白样品的OD值;ODp为试验的OD值;ODc为对照的OD值。

2 结果和分析

2.1 碳、氮源对YM 328胞外多糖发酵的影响

当以5 g/L蛋白胨为氮源，20 g/L麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖和CMC-Na为碳源时，YM 328胞外多糖产量如图1a所示。从图1a可看出，以葡萄糖为碳源时，YM 328胞外多糖产量最高，说明以葡萄糖为碳源便于菌株YM 328的利用和多糖的积累。氮源对菌株YM 328胞外多糖产量的影响较大。当以葡萄糖为碳源，酵母膏为氮源时，YM 328胞外多糖的产量最高，达到1.841mg/m L，如图1b所示。

图1 碳氮源对YM 328胞外多糖产量的影响

2.2 金属离子对YM 328胞外多糖发酵的影响

金属离子对菌株YM 328胞外多糖发酵的影响如图2所示。由图2可知，除Cu2+外，添加Mg2+、Fe2+、Zn2+、M n2+对YM 328胞外多糖的产量都有很大的影响，由此可以推测金属离子对于多糖的合成起重要作用，具体机理尚待研究。

图2 金属离子对胞外多糖产量的影响

2.3 培养时间对YM 328胞外多糖发酵的影响

培养时间对YM 328胞外多糖发酵的影响如图3所示。由图3可知，YM 328胞外多糖发酵到10 d时，其产量达到1.548 mg/m L，随着发酵时间的延长，多糖产量较稳定，直到14 d后多糖产量有所下降。

图3 培养时间对胞外多糖产量的影响

2.4 正交试验

YM 328胞外多糖发酵的正交试验极差分析结果见表1所列。

表1 YM 328胞外多糖发酵正交试验结果

由表1可知，影响YM 328胞外多糖产量的因素依次是C(金属离子)＞B(氮源)＞A(碳源)。由试验结果可直接得其最佳组合为A3B3C2，最佳发酵条件为:ρ(葡萄糖)=20 g/L，ρ(酵母膏)= 5 g/L，ρ(硫酸锰)=0.075 g/L。这与直观分析所得试验多糖产量最大有差异，故进行验证试验。在此条件下进行验证试验得出胞外多糖最大产量为1.895m g/m L。

2.3.1.2 术后6周后Harris髋关节功能评分 纳入了4个研究，共179例(SuperPATH组89例，传统入路组90例)，经χ2检验，研究间有异质性 ( I2>50%)，采用随机效应模型进行统一Meta 分析。结果显示：SuperPATH组术后6周后Harris髋关节功能评分优于传统入路组，且差异有统计学意义(WMD=7.62，95%CI=2.09～13.16，P=0.007)。见图2。

方差分析见表2所列。由表2可以看出，A因素对该多糖的产率没有显著影响，B因素对该多糖的产率具有显著影响，C因素对其产量具有高度显著影响。

表2 方差分析

2.5 YM 328胞外多糖对◦OH的清除作用

YM 328胞外多糖对◦OH的清除如图4所示，由图4可知，YM 328多糖对◦OH有清除作用，而且随着质量浓度的增加，对◦OH的清除作用增强，且清除能力均高于等质量浓度的VC。

图4 YM 328胞外多糖对◦OH的清除作用

2.6 YM 328胞外多糖对亚硝基的清除作用

YM 328胞外多糖对亚硝基的清除如图5所示，由图 5可知，随着多糖质量浓度的增加，YM 328胞外多糖对亚硝基的清除作用逐渐增强，但清除能力均弱于等质量浓度的VC。当质量浓度为1 g/L时，两者对亚硝基的清除能力差异较大，分别为51.07%和65.32%。

图5 YM 328胞外多糖对亚硝基的清除作用

3 结束语

本研究表明，碳源、氮源、金属离子及培养时间对 YM 328胞外多糖产量都有不同程度的影响。在最佳发酵条件下，多糖产量比在基础发酵培养条件下培养10 d的产量提高了36.27%，说明发酵条件对YM 328多糖代谢具有重要的调控作用。

YM 328胞外多糖对◦OH和亚硝基离子的清除作用随着多糖质量浓度的增加，呈增强的趋势。◦OH是生物体内主要的活性自由基，由它引发的体内脂质过氧化是机体衰老、心血管病及肿瘤发生的重要原因[19]。文献[20]报道大球盖菇多糖(质量浓度为583.1 mg/L)对◦OH的清除率为50%，而在本研究中40 mg/L的YM 328胞外多糖对◦OH的清除率就已达到50.98%，这说明粒毛盘菌胞外多糖对◦OH的清除作用较强，是一种很有开发潜力的抗氧化、防衰老的活性物质。

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