奥美沙坦酯对心肌梗死小鼠NADPH氧化酶的作用

张 恒，刘是中

(中国医科大学临床医药学院，沈阳110001)

体内外研究表明，奥美沙坦酯(OLM)可以阻断任何来源的血管紧张素Ⅱ所致的相应生理作用［1］。本实验通过结扎冠状动脉建立小鼠心肌梗死(MI)模型，应用OLM进行干预性治疗，观察各组动物的心肌纤维化情况、心肌丙二醛(MDA)含量及NADPH氧化酶组分的表达，探讨OLM的抗氧化应激作用及对MI后心脏的保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄健康雄性清洁级C57小鼠40只，体质量25～30 g，光照12 h/12 h明暗交替，室温饲养，由中国医科大学实验动物中心提供。

1.2 试剂及仪器 OLM(上海三共制药有限公司，上海);MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);RNA提取试剂盒，cDNA合成试剂盒(宝日医生物技术有限公司，大连);Real-time PCR反应试剂盒(Applied Biosystems，美国);引物(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海);人工呼吸机(HX－100E型，成都泰盟科技有限公司，成都);酶标光度计(SUNRISE RC，TECAN，瑞士)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立及分组 随机分为3组:假手术组(SHAM组，n=8)、MI组(n=10)和OLM组(n =8)。各组小鼠按50 mg/kg腹腔注射苯巴比妥钠麻醉，人工呼吸机辅助呼吸。迅速打开左前胸，暴露心脏。用7/0尼龙丝线在左心耳下方2 mm结扎冠状动脉左前降支，显微镜下确认，将心脏复位后挤压出胸腔内气体，迅速缝合关闭胸腔，建立MI模型。SHAM组穿线而不结扎动脉，余步骤同MI、OLM组。SHAM组、MI组每天给予正常饲料和饮水，OLM组术后给予正常饲料和饮水的同时开始给予OLM 10 mg/(kg·d)灌胃。3组小鼠术后4周处死并检测各项指标。

1.3.2 MDA含量的测定 小鼠处死后取出心脏，并用冰生理盐水洗净，剪除左右心房、大血管及附着结缔组织，取左心室(游离壁和室间隔)非梗死区组织称重，按1∶9(w∶v)用玻璃匀浆器在4℃制备组织匀浆。3 000 r/min离心15 min，吸取上清待测。心肌组织蛋白定量用Bradford比色法。MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.3.3 病理学改变检测 实验完成后取心脏组织，吸干表面水分，垂直于心脏左室长轴对称中点平乳头肌水平切取厚度为2～3 mm心脏切片，立即置于甲醛溶液中固定，石蜡包埋成蜡块，切成3 μm切片，AZAN染色后光镜下观察结构改变。

1.3.4 Real-time PCR法检测 取各组心脏左心室非梗死区组织，按照试剂盒要求提取总RNA，并将RNA反转录成cDNA，设计相应的引物，应用SYBR Green PCR master mix，在ABI Prism 7900T序列检测系统检测分析，反应条件为20 μl反应体系，按94℃ 30 s，然后94℃ 5 s，55℃ 5 s，72℃ 15 s扩增40个循环，分析溶解曲线，计算gp91phox、p22phox和 p47phox样本的相对浓度。PCR引物:gp91phox上游:5'-CTTTCTCAGGGGTTCCAGTG-3'，下游:5'-TCTTCCAAACTCTCCGCAGT-3';p22phox上游:5'-TGGACGTTTCACACAGTGGT-3'，下游:5'-TAGGCTCAATGGGAGTCCAC-3';p47phox上游:5'-CCACGG GTATTGCTAGGATGA-3'，下游:5'-AGACTAAGGCA GCGGGTAATCA-3';GAPDH上游:5'-CAACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'，下游:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACAC-3'。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0软件包行单因素方差分析，数据以s表示，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病死率及一般情况 SHAM组术后均存活，且一般情况佳;MI组病死率为20%，死因为心力衰竭，其余小鼠均不同程度出现呼吸急促、进食和活动减少等情况;OLM组小鼠均存活，但有轻微的进食、活动减少等情况出现。

2.2 MDA含量 SHAM组、MI组及OLM组心肌组织MDA水平分别为(11.4±1.21)、(27.3±4.18)及(17.8±2.35)nmol/mg prot，与SHAM组相比，MI组心肌组织MDA水平增高(P＜0.05);与MI组相比，OLM组MDA水平降低(P＜0.05)。

2.3 病理结果 AZAN染色结果可见SHAM组小鼠心肌肌肉束饱满，排列整齐，染成鲜红色。而MI组小鼠的心肌组织中梗死区蓝染，心肌纤维消失，代之以纤维结缔组织。OLM组亦可见蓝染的纤维结缔组织，但与MI组相比面积减少。

2.4 gp91phox、p22phox和p47phox mRNA表达见表1。

表2 不同组别心肌组织中gp91phox、p22phox和p47phox mRNA表达比较(n=8，s)

表2 不同组别心肌组织中gp91phox、p22phox和p47phox mRNA表达比较(n=8，s)

注:与SHAM组比较，*P＜0.05;与MI组比较，△P＜0.05

gp91phox p22phox p47phox SHAM组组别0.2±0.05 1.05±0.07 1.0±0.11 MI组 1.36±0.07* 2.15±0.14* 1.57±0.06* OLM组 0.45±0.09△ 1.65±0.09△ 1.23±0.09△

3 讨论

体内活性氧(ROS)被认为是氧化应激的主要原因［2］，包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧、过氧化脂类等。虽然心脏中ROS来源广泛，但研究发现NADPH氧化酶是产生ROS的重要来源［3］。NADPH氧化酶由2个膜结合成份(gp91phox和p22phox)，3个胞质成份(p47phox、p67phox和p40phox)，以及1个小分子G蛋白(rac-1或rac-2)组成［4］。研究发现，NADPH氧化酶可催化O2产生超氧阴离子，后者可通过岐化作用生成过氧化氢，过氧化氢进而能与超氧阴离子反应生成羟自由基，如此产生的大量的ROS可以导致氧化与抗氧化水平的失衡而引起细胞氧化应激损伤。

在正常及病理条件下，NADPH氧化酶源ROS对决定细胞内的氧化-还原平衡是至关重要的。心血管系统非吞噬细胞NADPH氧化酶为组成性表达，可持续生成低水平的超氧化物。然而在生理及病理条件下，NADPH氧化酶也可产生爆发性超氧化物。目前认为，NADPH氧化酶是心脏中超氧阴离子产生的最主要的调控酶之一［5］。研究显示，MI后ROS产生增加与AngⅡ上调NADPH氧化酶密切相关，AngⅡ可与AngⅡ1型受体结合而激活NADPH氧化酶，启动活性氧的生成［6］。随着NADPH氧化酶活性表达的增加，氧化应激的程度也随之加重。

Yu等［7］报道使用AngⅡ受体阻断剂可抑制心衰大鼠心肌氧化应激水平及心室重构。本研究中，我们的结果也显示，MI后心肌发生氧化应激损伤，膜脂过氧化最重要的产物之一MDA含量及NADPH氧化酶组分表达显著升高，应用AngⅡ受体阻断剂OLM后，MDA含量及NADPH氧化酶组分表达显著降低，MI面积明显减少，心肌损伤明显减轻。说明OLM对NADPH氧化酶系统激活有良好的抑制作用。但是OLM未能完全抑制心脏氧化应激的发展，说明NADPH氧化酶不是心脏ROS生成的惟一来源。详细机制有待进一步的研究。

［1］Koike H，Sada T，Mizuno M.In vitro and in vivo pharmacology of olmesartan medoxomil，an angiotensinⅡtype AT1 receptor antagonist［J］.J Hypertens Suppl，2001，19(1):S3-14.

［2］Martinon F.Signaling by ROS drives inflammasome activation［J］.Eur J Immunol，2010，40(3):616-619.

［3］Chan EC，Jiang F，Peshavariya HM，et al.Regulation of cell proliferation by NADPH oxidase-mediated signaling:potential roles in tissue repair，regenerative medicine and tissue engineering［J］.Pharmacol Ther，2009，122(2):97-108.

［4］Brandes RP，Kreuzer J.Vascular NADPH oxidases:molecular mechanisms of activation［J］.Cardiovasc Res，2005，65(1):16-27.

［5］Inagi R.Oxidative stress in cardiovascular disease:a new avenue toward future therapeutic approaches［J］.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2006，1(2):151-159.

［6］Garrido AM，Griendling KK.NADPH oxidases and angiotensinⅡreceptor signaling［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，302(2):148-158.

［7］Yu Y，Fukuda N，Yao EH，et al.Effects of an ARB on endothelial progenitor cell function and cardiovascular oxidation in hypertension［J］.Am J Hypertens，2008，21(1):72-77.