沉默DNA结合抑制蛋白-1基因对腺样囊性癌细胞生长和侵袭能力的影响

刘培 张向红 胡振生 孙善珍 刘少华 魏奉才

（1.山东大学齐鲁医院 整形外科； 2.山东大学医学院 组织胚胎学教研室；

3.山东大学口腔医院 病理科；4.山东大学齐鲁医院 口腔科研究室，济南 250012）

沉默DNA结合抑制蛋白-1基因对腺样囊性癌细胞生长和侵袭能力的影响

刘培1张向红2胡振生1孙善珍3刘少华4魏奉才4

（1.山东大学齐鲁医院 整形外科； 2.山东大学医学院 组织胚胎学教研室；

3.山东大学口腔医院 病理科；4.山东大学齐鲁医院 口腔科研究室，济南 250012）

目的 探讨DNA结合抑制蛋白-1（Id-1）基因在腺样囊性癌细胞生长和侵袭行为中的作用。方法 以涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M和ACC-2为研究对象，免疫荧光检测Id-1基因的表达；用小干扰RNA进行Id-1基因的RNA干扰；于干扰前后应用RT－PCR和Western blot检测2个细胞系Id-1表达情况；于干扰前后应用MTT法检测细胞的生长情况及用Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果 在ACC-M和ACC-2中，Id-1均有表达，ACC-M表达量高于ACC-2；通过RNA干扰沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2的生长和侵袭能力均受到抑制。在受抑制程度上，ACC-M比ACC-2更为强烈。结论 鉴于Id-1对ACC细胞生长和侵袭行为的重要影响，干扰Id-1基因的表达，有望成为治疗腺样囊性癌新的有效方法之一。

DNA结合抑制蛋白-1； 腺样囊性癌； 增殖； 侵袭

腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是发生于头颈部涎腺最常见的恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤20%[1]，具有高度的侵袭和转移特性[2]。由于对ACC生物学性质认识上的局限性，目前尚无很有效的治疗措施，即使进行了广泛的手术切除及放射治疗，大多数患者最终还是出现复发和转移[3]。临床上急需寻求治疗ACC的新方法。

DNA结合抑制蛋白（inhibitor of DNA binding，Id）属于螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）转录调节因子家族，在细胞生长和分化方面具有广泛的调节作用。Id蛋白有4个家族：Id-1、Id-2、Id-3、 Id-4，目前研究[4-5]发现：Id-1与人类多种肿瘤的发生发展有密切的关系。然而在ACC中，Id-1的表达量如何，其对ACC的生长和侵袭能力的影响尚不得而知。

ACC-M和ACC-2分别是涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株和低转移细胞株，本研究通过检测其Id-1基因的表达，以及Id-1 RNA干扰前后2个细胞系的生长和侵袭能力的变化，探讨Id-1基因对ACC的生长和侵袭能力的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

腺样囊性癌细胞系ACC-M（购自中国典型培养物保藏中心），ACC-2（山东大学齐鲁医院肿瘤中心实验室冻存）；DMEM（Gibco公司，美国），opti-MEM（Invitrogen公司，美国），胎牛血清（Gibco公司，美国），脂质体Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美国），兔抗鼠Id-1抗体（SC-488，Santa Cruz公司，美国），FITC标记的羊抗兔抗体（Southern Biotech公司，美国），Id-1 siRNA（Invitrogen公司，美国），噻唑蓝（Sigma公司，美国）；BioCoat Matrigel侵袭小室（24孔，8μm，Becton Dickinson公司，美国），LSM710激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）。

1.2 细胞培养

腺样囊性癌细胞系ACC-M和ACC-2解冻复苏，于含10%胎牛血清的DMEM培养基、37℃、含5% CO2的细胞培养箱中密闭培养。不加入青霉素和链霉素。

1.3 RNA干扰

应用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默Id-1基因。ACC-M和ACC-2分别分为4组：空白对照组、脂质体对照组、序列错配siRNA组和Id-1siRNA组。取处于对数生长期的细胞，调整细胞密度为每孔1×105个接种于6孔板，在含10%胎牛血清的DMEM中培养24 h，将培养基换成无胎牛血清的opti-MEM，培养至细胞贴壁长满底面积的50%时行转染实验。每孔加入100 pmol Id-1 siRNA和5μL lipofectamine2000。Id-1（NM_002165）siRNA序列：5’-UGAGUAACAGCCGUUCAUGUCGUAG-3’，5’-CUACGACAUGAACGGCUGUUACUCA-3’。

1.4 免疫荧光确认干扰成功

制备单细胞来源细胞爬片，0.01 mol·L-1PBS清洗5min×3次；2.5mL·L-1TritonX-100处理15min；PBS振洗5min×3次。正常羊血清封闭。一抗滴加1∶150稀释的兔抗鼠Id-1抗体，4℃湿盒过夜，37℃复温1 h，PBS振洗5min×3次；分别滴加1∶50稀释的FITC标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBS振洗5min×2次，蒸馏水振洗1次，用500mL·L-1无荧光缓冲液甘油封片，阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤不变。使用激光扫描共聚焦显微镜（激发波长488 nm）进行观察和定量检测。

1.5 RNA干扰前后的RT-PCR和Western blot检测

1.5.1 总RNA的提取及RT-PCR扩增 用Trizol常规提取ACC-M和ACC-2细胞总RNA，经逆转录合成cDNA进行PCR反应。采用高保真Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。引物序列见表1。扩增条件为：95℃5min，94℃ 40 s,56℃ 40 s，72℃ 40 s，36个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，分离得到的条带用计算机图像分析软件进行。

表1 引物序列以及PCR产物大小Tab 1 Primer sequences and size of PCR products

1.5.2 Western blot检测ACC-M和ACC-2细胞RNA干扰前后Id-1蛋白的表达 细胞培养72 h以后常规方法提取细胞总蛋白。灌制15%的SDS-PAGE凝胶，每孔上样20mg，电泳分离，转膜。2%BSA室温封闭1 h；一抗室温孵育1 h（其中兔抗鼠Id-1一抗质量浓度为1 g·mL-1，β-actin以1∶5 000稀释）；用TBST洗3遍；二抗室温孵育1 h（抗兔IgG 1∶1 000稀释）；TBST洗3遍。最后用化学发光试剂检测信号，条带强度应用图像分析软件进行分析。

1.6 细胞生长曲线

接种上述细胞于96孔板，接种密度为每毫升5×104个，每孔接种0.2mL，转染24、48、72 h后，应用MTT比色法于570 nm处测定吸光度A值，描记细胞的生长曲线，每组设6个样本。

1.7 细胞侵袭性

50mg·L-1Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部，4℃风干。上室加入含有1×104个细胞的100μL DMEM，下室加入含有条件培养基作为趋化因子的600μL DMEM，孵育20 h以后，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，95%乙醇固定，苏木素染色。在200倍倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞。每个样本计数6个视野。

1.8 统计学分析

测量数据以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0统计学软件进行t检验和ANOVA检验。P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 免疫荧光检测Id-1表达

干扰前，ACC-M和ACC-2均表达Id-1，其中ACC-M表达量远高于ACC-2（图1）。干扰后，ACCM和ACC-2的Id-1表达量均明显下降，而ACC-M的下降量尤为显著（图1）。Id-1 siRNA组均与空白对照组、脂质体对照组以及序列错配组有显著差异（均为P＜0.01），空白对照组、脂质体对照组和序列错配组之间并无显著差异（均为P＞0.05）。

2.2 RT-PCR和Western blot检测RNA干扰前后Id-1表达

RT-PCR和Western blot结果见图2。RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测到的Id-1mRNA水平和Western blot检测到的Id-1蛋白水平结果一致：干扰前，ACC-M和ACC-2均表达Id-1，ACC-M表达量远高于ACC-2；干扰后，ACC-M和ACC-2的Id-1表达量均明显下降，而ACC-M的下降量尤为显著。Id-1 siRNA组与空白对照组、脂质体对照组以及序列错配组有显著差异（均为P＜0.01），空白对照组、脂质体对照组和序列错配组间无显著差异（均为P＞0.05）。

2.3 细胞生长曲线

干扰前，ACC-M和ACC-2均正常生长，其中ACC-M生长速度远快于ACC-2。干扰后，ACC-M和ACC-2的生长速度均明显减慢，而ACC-M的减慢尤为显著（图3）。Id-1 siRNA组均与空白对照组、脂质体对照组以及序列错配组有差异，且差异有统计学意义（均为P＜0.01），空白对照组、脂质体对照组和序列错配组之间相比，差异无统计学意义（均为P＞0.05）。

2.4 细胞侵袭性

干扰前，ACC-M和ACC-2均具有侵袭性，其中ACC-M侵袭性远大于ACC-2（图4）。干扰后，ACCM和ACC-2的侵袭性均明显减小，而ACC-M的减小尤为显著（图4）。Id-1 siRNA组均与空白对照组、脂质体对照组以及序列错配组有差异，且差异有统计学意义（均为P＜0.01），空白对照组、脂质体对照组和序列错配组之间相比，差异无统计学意义（均为P＞0.05）。

图3 ACC-M和ACC-2细胞生长曲线Fig 3 The cell proliferation curves of ACC-Mand ACC-2 cells

图4 ACC-M和ACC-2细胞Transwell侵袭能力检测Fig 4 Invasive ability of ACC-MandACC-2 cells detected by Transwell

3 讨论

Id蛋白属于HLH蛋白质超家族，相对分子质量为13 000～20 000，它是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。bHLH蛋白二聚体的形成是DNA与E盒（CANNTG）或N盒（CACNAG）识别序列结合的必要条件，Id蛋白通过与bHLH转录因子形成异型二聚体，干扰其与DNA的结合，阻断其对下游分子的转录激活作用，抑制基因的表达，从而抑制细胞的正常分化，促进细胞增殖[4]。Id-1是人类迄今为止发现的4个Id蛋白家族成员中研究最多，也是最重要的一个。研究发现：Id-1在上皮来源的肿瘤中呈高表达，它通过抑制细胞正常分化、推进细胞周期进程、诱导细胞增殖、抑制衰老、诱导侵袭、参与肿瘤性血管新生而介导肿瘤的发生和发展[6-9]；在大肠癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌的发生发展过程中都发挥着重要的作用[10-14]。

ACC是口腔颌面部常见的涎腺恶性肿瘤，其临床生物学行为突出特征之一是易发生肺转移，转移率高达40%以上[1-2]。ACC-M（涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株）和ACC-2（涎腺腺样囊性癌肺低转移细胞株）这2种细胞为同一亲本，二者的差异集中在转移表型上，转移性具有显著差异，ACC-M转移率为96%，ACC-2转移率为18%[15]。追其本源，ACC-M细胞株是由ACC-2细胞株单克隆培养而来，前者的增殖能力和侵袭能力远远强于后者。本研究发现：ACC-M中Id-1的表达量远远高于ACC-2，提示Id-1的表达量与ACC-M和ACC-2增殖和侵袭能力的差别是成正相关的，即Id-1表达的不同可能造成ACC-M和ACC-2增殖和侵袭能力的不同。

以往研究发现的与肿瘤相关的Id-1信号通路有很多，有Akt介导的Wnt、p53和NF-kappa B、PI3K/ Akt/NF-kappa B和Erk/MAPK信号通路[16-19]等。本课题组前期研究发现：正常涎腺组织中Id-1的表达量非常低（甚至难以检测到），但是在涎腺腺样囊性癌中却呈现高表达，这说明Id-1表达水平的升高可能打破了正常细胞内癌基因与抑癌基因相互制约的平衡关系，进而激活某条或多条信号传导通路推进细胞周期进程、抑制细胞分化、促进细胞增殖，从而诱导正常细胞向肿瘤细胞转化，增加通过淋巴管道和血道向周围淋巴结和远处器官侵袭和转移的机会。

本研究发现：在ACC-M和ACC-2中，Id-1均有表达，ACC-M表达量高于ACC-2；通过RNA干扰沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2生长均受到抑制，ACC-M比ACC-2受到更强烈的抑制；同样，通过RNA干扰沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2侵袭能力均受到抑制，ACC-M比ACC-2受到更强烈的抑制。其机制可能是通过沉默Id-1基因，腺样囊性癌细胞系ACC-M和ACC-2本来呈现高表达的Id-1出现低表达或者无表达，本来被打破了的癌基因与抑癌基因相互制约的平衡关系恢复了正常，激活了的某些信号传导通路得到抑制或者关闭，抑制细胞周期进程、促进细胞分化、抑制细胞增殖，抑制了通过淋巴管道和血道向周围淋巴结和远处器官侵袭和转移的机会。但是Id-1对ACC生长和侵袭起调节作用的精确信号传导通路，还有待进一步的研究与探讨。

本研究表明：应用siRNA沉默Id-1基因，可以显著抑制ACC-M和ACC-2细胞的生长和侵袭。提示干扰Id-1基因的表达，可能有望成为治疗腺样囊性癌新的有效方法。

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（本文编辑 汤亚玲）

Effects of silencing inhibitor of DNA binding-1 gene on the grow th and invasiveness of adenoid cystic carcinoma cells

LIU Pei1,ZHANG Xiang-hong2,HU Zhen-sheng1,SUN Shan-zhen3,LIU Shao-hua4,WEI Feng-cai4.（1.Dept.of Plastic Surgery,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan250012,China；2.Dept.of Histology and Embryology,School of Medicine,Shandong University,Jinan250012,China；3.Dept.of Pathology,School of Stomatology,Shandong University,Jinan250012,China；4.Research Section of Stomatology,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan250012,China）

ObjectiveTo investigate the role of inhibitor of DNA binding-1（Id-1）gene in adenoid cystic carcinoma cell growth and invasion behavior.MethodsWith salivary adenoid cystic carcinoma cell lines ACC-Mand ACC-2,dedected Id-1 gene expression was screened with immunofluorescence assay.After Id-1 mRNA knockingdown using small interfering RNA,RT-PCR and Western blot were used to detect the different expressions before and after interference,and the growth of cells before and after interference was deceted using the MTT assay,and the cell invasion ability was checked with the use of Transwell chamber assay.Results Id-1 were both expressed in the ACC-Mand ACC-2,and the expression in ACC-M was higher than that in ACC-2.After Id-1 RNA interference,the growth and invasiveness of ACC-Mand ACC-2 were inhibited with the restrained degree in ACC-M much stronger than that in the ACC-2.ConclusionIn view of the important role of Id-1 in the behavior of growth and invasion in ACC cell,interfering the expression of Id-1 gene is expected to be a novel and effective means for the treatment of adenoid cystic carcinoma.

inhibitor of DNA binding-1； adenoid cystic carcinoma； proliferation； invasion

R 739.87

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.016

1000－1182（2011）01－0066-05

2009-11-25；

2010-03-02

国家自然科学基金资助项目（30672339）；教育部留学回国人员科研启动基金资助项目（2007）

刘培（1982—），女，山东人，博士

刘少华，Tel：0531-82169247